结肠N-甲基-D-天冬氨酸受体参与肠易激综合征内脏高敏感发病机制的研究

发布时间：2017-09-06 13:10

  本文关键词：结肠N-甲基-D-天冬氨酸受体参与肠易激综合征内脏高敏感发病机制的研究

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【摘要】：背景和目的肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一种常见的功能性胃肠病,严重影响患者的生活质量,增加医疗资源消费,带来严重的社会及经济负担。腹痛、腹部不适是IBS最常见的就诊症状,而内脏高敏感被认为是腹痛、腹部不适发生的最主要机制。然而,直到目前,对于IBS内脏高敏感的具体发病机制仍处于不断探索之中。既往关于此方面的研究主要集中于消化道相关神经系统的神经元和神经纤维的功能,主要包括中枢致敏和外周致敏。作为消化道重要组成部分的结肠黏膜细胞,一方面能够直接触肠腔环境,另一方面在解剖结构上还同时直接毗邻结肠黏膜下层组织。这些结肠黏膜细胞能够感知结肠腔内环境的各种信号,并传递给位于结肠深层的肠神经系统,进而参与多种消化系统疾病的发生发展过程。因此,结肠黏膜细胞或许是研究IBS内脏高敏感的一个非常有意义的靶点。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体是一种离子型谷氨酸受体,以NR1为其组成的必需亚基,此受体在神经系统广泛表达并参与兴奋性突触传递过程。既往多项研究已经证实中枢和外周广泛表达的NMDA受体参与了内脏高敏感状态的发生过程。而且,既往的研究已经发现,NMDA受体不仅表达在神经系统细胞,在非神经系统细胞和组织,如巨噬细胞、角质细胞、骨细胞以及甲状旁腺中均有表达并发挥相应的病理生理作用。然而,目前尚不清楚NMDA受体是否在内脏高敏感状态的结肠黏膜表达以及是否参与内脏高敏感的发生。之前的研究已经证实,神经细胞表面的NMDA受体被激活之后,能够活化细胞内的细胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinase, ERK)信号通路,从而使脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的合成和释放增加。而BDNF是一种神经营养因子,参与多种疼痛过程的发生。我们课题组前期的研究发现,BDNF广泛表达于结肠黏膜细胞,并通过影响结肠相关神经的结构和功能介导IBS的内脏高敏感。因此,我们推测,结肠黏膜表达NMDA受体,并参与了IBS内脏高敏感的发生。而这一过程的可能机制是,结肠黏膜NMD A受体活化之后激活细胞内的ERK信号通路,进而引起疼痛介质BDNF的合成和释放增多,从而进一步导致了IBS内脏高敏感的发生。本研究分两个部分,对以上问题和假说进行探讨和验证。第一部分内容探讨NMDA受体在结肠黏膜中的表达改变及与内脏高敏感症状的相关性,包括：1.IBS患者及健康对照者结肠黏膜NMD A受体的表达改变,及其表达水平与患者腹部症状的关联性分析；2.内脏高敏感小鼠模型的建立,小鼠结肠黏膜NMD A受体的表达水平、内脏敏感性变化及二者的关联性分析。第二部分内容通过体内及体外实验,探讨结肠NMDA受体参与肠易激综合征内脏高敏感发生的可能机制及信号通路,包括：1.使用动物实验,探讨结肠黏膜NMDA受体活化之后是否会引起内脏敏感性的相应变化,并探讨NMDA受体活化对BDNF和ERK通路蛋白的影响；2.使用体外培养的结肠细胞,进一步对上述假说进行验证,探索结肠NMDA受体活化之后可能的下游信号通路及蛋白变化。方法第一部分依据功能性胃肠病罗马Ⅲ标准纳入IBS患者,并根据粪便性状不同,将纳入的IBS患者进一步分为腹泻型肠易激综合征(IBS with diarrhea, IBS-D)和便秘型肠易激综合征(IBS with constipation, IBS-C)。对照组纳入人群为因为结肠息肉或结肠癌筛查而接受结肠镜检查者,所有的内镜检查均无异常。首先使用症状评分量表对所有纳入受试对象的腹痛、腹部不适症状发作的严重程度和发作频率进行评分量化,之后进行结肠镜检查,并在直肠乙状结肠交界处钳取结肠黏膜标本,用于NMDA受体免疫组化染色及western blot检测,并分析NMDA受体蛋白表达水平与腹部症状评分之间的相关性。因为NR1是组成NMDA受体的必需亚基,因此使用NRl抗体可以标记所有的NMDA受体亚型,在本研究的免疫组化和western b lot实验中我们使用NR1抗体对NMDA受体的表达进行检测,并使用缩写“NRl”代表NMDA受体的表达。将体重为20-30g的雄性C57BL/6、鼠,使用TNBS进行灌肠处理,建立内脏高敏感动物模型。对照组小鼠使用同样方法,给予同等剂量的50%乙醇溶液灌肠。使用针对小鼠肠炎的疾病活动指数(disease activity index, DAI)对灌肠后小鼠肠炎的严重程度进行评估。灌肠结束4周后,应用结直肠扩张(colorectal distention, C D)后小鼠腹部撤回反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)评分对小鼠内脏敏感性进行检测。获取小鼠结肠标本,进行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色,评估小鼠结肠组织学炎症状况。使用免疫组化及western blot对小鼠结肠黏膜NMD A受体表达水平进行检测,并分析蛋白表达水平与内脏敏感性AWR评分之间的关联性。第二部分取第一部分研究中TNBS灌肠造模之后的小鼠粪便,检测粪便中NMDA受体潜在激动剂glutamate 和 ammonia的含量变化,并与对照组小鼠作对比。对正常小鼠进行ammonia灌肠处理(200 mM、500 mM及1 M,每只小鼠0.1mL),每天灌注1次,连续3天；对照组小鼠使用生理盐水灌肠。为验证NMDA受体的作用,在抑制性实验中,每天ammonia灌注之前30分钟,给予小鼠灌注配制好的NMDA受体拮抗剂MK801 (0.1、1.0及10mg/kg)。第三天灌注结束后,对各组小鼠进行CRD之后的AWR评分检测,以评估接受不同处理之后小鼠内脏敏感性的变化。使用NMDA受体特异性的激动剂NMDA溶液对正常小鼠进行结肠灌注(10mg/kg),每天灌注1次,连续3天；对照组小鼠使用PBS灌肠。另取小鼠,在每天NMDA灌注之前30分钟,灌注配制好的NMDA受体拮抗剂MK801溶液(10mg/kg),或ERK通路拮抗剂U0126 (10 mg/kg),或BDNF特异性受体TrkB的特异性拮抗剂TrkB/Fc (10 ng/小鼠)。第三天灌注结束后,对各组小鼠进行CRD之后的腹壁肌电检测,评估各组小鼠内脏敏感性的变化。腹壁肌电检测结束之后,将小鼠处死,获取远端结肠标本,在解剖显微镜下,使用解剖剪、眼科镊等工具将结肠黏膜层与黏膜下层进行钝性分离,获得结肠黏膜标本。使用western blot技术对小鼠结肠黏膜标本中BDNF、ERK通路蛋白的表达水平进行检测。生长状态良好的体外培养的结肠上皮细胞HT29,饥饿处理24小时后,加入不同浓度的NMDA (50μM、100 μM及200μM)刺激细胞。在抑制性实验中,NMDA加入之前30分钟,分别加入NMDA受体拮抗剂MK801(10μM)或ERK通路拮抗剂U0126 (1 0nM)。PBS处理组细胞作为对照组。收集各组细胞上清,ELISA方法检测上清中BDNF的含量变化；提取细胞蛋白,western blot方法检测细胞中BDNF、ERK通路蛋白的变化。结果第一部分1.研究对象临床资料研究总共纳入18位健康对照者,以及37位IBS患者,其中21位(56.8%)为IBS-D患者,16位(43.2%)为IBS-C患者。对于腹部症状严重程度评分,IBS患者显著高于对照者(2.41±1.01 vs.0.17±0.38,P0.001),而IBS-D患者和IBS-C患者之间无差异(2.48±1.03 vs.2.31±1.01,P0.63)。对于腹部症状发作频率评分,IBS患者同样显著高于对照者(2.30±1.10 vs.0.22±0.55,P0.001), IBS-D患者和IBS-C患者之间无差异(2.33±1.24 vs.2.25±0.93,P=0.82)。2.NRl蛋白在人结肠黏膜的表达使用免疫组化技术,我们发现,目的蛋白NR1在人结肠黏膜广泛表达,主要表达在结肠上皮细胞和固有层细胞。3.人结肠黏膜NRl的免疫组化定量分析及与腹部症状之间的关联性分析免疫组化定量分析结果显示,IBS患者结肠黏膜NR1的表达显著高于对照组(IBS：中位数33.51,IQR 26.66-46.70；对照组：中位数25.35,IQR 13.60-35.66；P=0.004)。IBS-D和IBS-C结肠黏膜NR1的表达量无显著差异(IBS-D：中位数33.97,IQR 26.66-47.30；IBS-C中位数：33.15,IQR 26.28-42.75；P=0.705)。在对照组、IBS患者组以及所有纳入者组,结肠黏膜NR1表达量与腹痛/腹部不适症状严重程度评分之间均存在显著关联性(对照组：r=0.560,P=0.016；IBS组：r=0.522,P=0.001；所有纳入者组：r=0.596,P0.001)。结肠黏膜NR1表达量与腹痛/腹部不适症状发作频率之间在各分组中同样存在显著关联性(对照组：r=0.568,P=0.014；IBS组：r=0.632,P0.001；所有纳入者组：r=0.663,P0.001)。4.人结肠黏膜NR1的western blot定量分析及与腹部症状之间的关联性分析对所得条带的光密度分析结果显示,与对照组相比,IBS-D与IBS-C患者结肠黏膜NR1的表达水平分别是对照组的1.71倍(P0.05)和1.51倍(P0.05),而IBS-D患者NR1表达量稍微高于IBS-C患者,但未达到统计学意义(P0.05)。关联性分析统计结果显示,在对照组、IBS患者组以及所有纳入者组,结肠黏膜NR1表达量与腹痛/腹部不适症状严重程度评分之间均存在显著关联性(对照组：r=0.646,O=0.004；IBS组：r=0.586,P0.001；所有纳入者组：r=0.669,P0.001)。结肠黏膜NR1表达量与腹痛/腹部不适症状发作频率之间在各分组中同样存在显著关联性(对照组：r=0.649,P=0.004；IBS组：r=0.551,P0.001；所有纳入者组：r=0.708,P0.001)。5.内脏高敏感小鼠模型的建立在对小鼠进行灌肠处理后,NBS灌肠小鼠的DAI评分在灌肠之后第1至7天时最高,之后逐渐降低,第21天时评分降至为0,表明结肠炎症恢复正常。灌肠处理后4周,显微镜下观察到的HE染色结果显示,TNBS组和对照组小鼠均无显著炎性表现。灌肠处理后4周,对两组小鼠结直肠扩张后的AWR评分进行记录,在15mmHg扩张压力下,TNBS组和对照组小鼠的内脏敏感性无显著差异；但是,在30、45和60 mmHg扩张压力下,TNBS组小鼠的AWR评分显著高于对照组小鼠,提示内脏敏感性的升高。6.NR1蛋白在小鼠结肠黏膜的表达免疫组化结果显示,NR1蛋白表达散布于整个小鼠结肠黏膜标本,其中在结肠上皮细胞和固有层细胞表达丰富。7.小鼠结肠黏膜NR1的免疫组化定量分析及与内脏敏感性之间的关联性分析免疫组化定量分析结果显示,TNBS处理组小鼠结肠黏膜NR1的表达量显著高于对照组小鼠(TNBS组：中位数19.7,IQR 15.4-26.9；对照组：11.7,IQR 9.8-14.5；P=0.019)。在TNBS组以及对照组小鼠,结肠黏膜NR1表达量与AWR评分之间存在显著关联性,尤其是45mmHg (TNBS组小鼠：r=0.831,P=0.003；对照组小鼠：r=0.766,P0.01)和60mmHg (TNBS组小鼠：r=0.668,P=0.035;对照组小鼠：r=0.875,P0.001)的结直肠扩张压力下。不考虑分组情况不同而将两组小鼠作为整体分析,结肠黏膜NR1表达量与AWR评分之间同样存在显著关联性,尤其是在30mmHg (r=0.741,P0.001)、45 mmHg (r=0.841,P0.001)和60 mmHg(r=0.738,P0.001)结直肠扩张压力下。8.小鼠结肠黏膜NR1的western blot定量分析及与内脏敏感性之间的关联性分析Western blot及光密度分析结果显示,TNBS组小鼠结肠黏膜NR1的表达量是对照组小鼠的1.74倍(P=0.014)。在TNBS组以及对照组小鼠,结肠黏膜NR1表达量与AWR评分之间存在显著关联性,尤其是在30mmHg (TNBS组小鼠：r=0.828,P=0.003；对照组小鼠：r-0.654, P=0.040)、45 mmHg(TNBS组小鼠：r=0.757,P=0.011；对照组小鼠：r=0.883,P0.001)的结直肠扩张压力下。不考虑分组情况不同而将两组小鼠作为整体分析,在所有4个不同的结直肠扩张压力下,结肠黏膜NR1表达量与AWR评分之间均存在显著关联性(15 mmHg:r=0.524,P=0.018; 30 mmHg:r=0.826,P 0.001; 45 mmHg:r=0.843,P0.001; 60 mmHg:r=0.641, P=0.002)。第二部分1.TNBS灌肠小鼠及对照组小鼠粪便中glutamate和 ammonia的含量测定灌肠处理小鼠后4周,我们获取TNBS组和对照组小鼠的粪便,并对粪便中潜在的NMDA受体激动剂glutamate和ammonia进行定量检测分析。两组小鼠粪便中glutamate的含量并无显著差异(17.4±0.1 nmol/g vs.17.7±0.1 nmol/g,P=0.085),但是TNBS组小鼠粪便中ammonia的含量显著高于对照组小鼠(15.4±1.7μg/g vs.10.2± 1.1 μg/g, P=0.017)。2.正常小鼠接受ammonia灌肠处理后内脏敏感性变化为了验证TNBS灌肠处理后小鼠肠腔粪便中有显著变化的ammonia是否能够激活结肠NMDA受体,并影响小鼠内脏敏感性,我们使用ammonia对正常小鼠进行灌肠处理,并记录CRD之后的AWR评分。结果发现,与对照组相比,ammonia灌肠处理能够显著增强小鼠的内脏敏感性,特别是在30 mmHg和45 mmHg扩张压力下。而ammonia处理导致的内脏敏感性的升高,能够被预先使用的NMDA受体特异性拮抗剂MK801所拮抗。3.正常小鼠接受NMDA灌肠处理后内脏敏感性变化为进一步明确结肠黏膜NMDA受体活化对小鼠内脏敏感性的作用,我们使用NMDA受体的特异性激动剂NMDA对正常小鼠进行灌肠处理,以更特异性地激活结肠黏膜NMDA受体,并使用CRD之后小鼠的腹壁肌电变化评估N MDA受体激活对小鼠内脏敏感性的改变。与对照组相比,在15 mmHg扩张压力下,NMDA (10mg/kg)对小鼠的内脏敏感性并无改变,但是,在30、45和60mmHg扩张压力下,NMDA处理组小鼠显示出对CRD更为强烈的反应。分别预先使用MK801、U0126和TrkB/Fc对NMDA受体、ERK通路和TrkB (BDNF的特异性作用受体)进行拮抗,均可显著抑制NMDA处理引起的内脏高敏感反应。4.正常小鼠接受NMDA灌肠处理后结肠BDNF的表达改变和ERK通路的活化为进一步探讨结肠黏膜NMDA受体活化后下游通路的变化,我们获取接受NMDA灌肠处理的小鼠结肠黏膜,使用western blot对结肠黏膜中的BDNF和ERK通路蛋白进行检测。结果发现,NMDA处理组小鼠结肠黏膜的BDNF含量显著高于对照组小鼠,MK801和U0126预处理均可显著抑制此效应。不同处理组小鼠结肠黏膜总的ERK含量并无差异,但是NMDA处理组小鼠结肠黏膜磷酸化的ERK (phosphorylated ERK, pERK)含量显著高于对照组,而MK801和U0126预处理均可显著抑制此效应。5.结肠上皮细胞NMDA受体活化后上清中BDNF的分泌改变ELISA结果显示,与对照处理组相比,使用NMDA对结肠上皮细胞HT29进行刺激之后,细胞上清中BDNF蛋白水平显著增加,并呈现剂量反应性增加的表现。为验证此种效应是否由NMDA受体活化以及ERK通路激活所介导,我们使用NMDA受体的拮抗剂MK801和ERK通路的拮抗剂U0126对细胞进行预处理,结果发现两种拮抗剂均可显著抑制NMDA引起的上清BDNF含量升高。6.结肠上皮细胞NMDA受体活化后细胞中BDNF的表达改变和ERK通路的活化Western blot结果显示,结肠上皮细胞HT29接受50μM、100μM和200 μMNMDA刺激之后,测得的细胞中BDNF的含量分别是对照组的1.47倍、2.43倍和2.60倍。使用MK801和U0126预处理能够抑制此效应。与对照处理相比,NMDA刺激之后,结肠上皮细胞中总ERK的表达水平并无变化,但pERK表达水平呈现剂量依赖性增加。使用MK801和U0126预处理能够抑制此效应。结论第一部分1.人结肠黏膜广泛表达NMD A受体,并且IBS患者中表达显著升高,结肠黏膜NMDA受体表达量与腹痛、腹部不适症状评分呈显著关联性。2. TNBS灌肠处理小鼠28天后可建立IBS样内脏高敏感动物模型,其结肠黏膜NMDA受体表达显著升高并与内脏敏感性AWR评分呈显著关联性。第二部分1.内脏高敏感小鼠肠腔内ammonia含量显著升高,肠腔内应用ammonia可引起正常小鼠内脏敏感性的升高。2.结肠黏膜NMDA受体活化可引起结肠BDNF合成和释放增加,进而导致内脏高敏感的发生。3.结肠黏膜NMDA受体活化后BDNF合成和释放的增加是通过活化细胞内ERK信号通路实现的。
【关键词】：结肠黏膜 N-甲基-D-天冬氨酸受体 肠易激综合征 内脏高敏感 发病机制
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574.4
【目录】：

• 中文摘要6-14
• 英文摘要14-24
• 符号说明24-26
• 第一部分 N-甲基-D-天冬氨酸受体在肠易激综合征患者及内脏高敏感小鼠结肠黏膜中的表达、改变及与内脏高敏感症状的相关性分析26-57
• 前言26-27
• 研究对象与方法27-40
• 结果40-43
• 讨论43-47
• 结论47-48
• 附图表48-57
• 第二部分 结肠N-甲基-D-天冬氨酸受体参与肠易激综合征内脏高敏感发生的机制研究：体内及体外实验57-77
• 前言57-58
• 研究对象与方法58-66
• 结果66-68
• 讨论68-71
• 结论71-72
• 附图72-77
• 参考文献77-84
• 致谢84-85
• 攻读博士学位期间发表的论文85-86
• 学位论文评阅及答辩情况表86-87
• 英文论文一87-111
• 英文论文二111-131

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本文编号：803304