固醇调节元件结合蛋白1c在脂性自噬中的作用及机制探讨

发布时间：2017-09-08 13:42

  本文关键词：固醇调节元件结合蛋白1c在脂性自噬中的作用及机制探讨

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【摘要】：背景和目的:研究证实,固醇调节元件结合蛋白1c(Sterol regulatory element binding protein 1 c,SREBP-1c)及自噬均参与了非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发生发展,但具体发生机制并不十分清楚。本研究的目的在于观察油酸(Oleic acid,OA),棕榈酸(Palmitic acid,PA)对大鼠H4IIE细胞SREBP-1c表达水平、自噬水平及凋亡水平的影响,试图探讨SREBP-1c是否通过调节脂性自噬及脂性凋亡而参与NAFLD的发生;探讨单磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated prokein kinase,AMPK)是否通过SREBP-1c参与大鼠脂肪肝相关性肝癌及肝癌前病变的形成,从而为NAFLD的防治提供实验依据。方法:体外实验:采用Nile Red染色及甘油三酯(Triglyceride,TG)含量测定方法检测OA/PA诱导的大鼠肝肿瘤细胞系H4IIE细胞脂质含量;采用透射电镜、Western blot、Real-time PCR、流式细胞术方法,检测细胞自噬、细胞凋亡及SREBP-1c的水平;采用胰岛素(Insulin,Ins)、雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)、过表达及敲减SREBP-1c的方法干预SREBP-1c,检测OA过载的细胞中脂质含量及细胞自噬的变化;采用p53特异性抑制剂Pftα抑制p53表达,检测干预SREBP-1c前后p53-Bax信号通路的变化及细胞凋亡率的变化。体内实验:采用HE染色、Western blot和Real-time PCR方法观察高脂饮食诱导的大鼠NAFLD肝组织病理学变化、SREBP-1c及自噬流的改变。利用腹腔注射低剂量二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)合并高脂饮食诱导的大鼠肝癌前病变模型,观察谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase-π,GST-π)、SREBP-1c、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶((acetyl-Co A carboxylase,ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-co A desaturase 1,SCD1)及AMPK、p-AMPK的表达变化。结果:1.OA过载的H4IIE细胞自噬水平增加,自噬功能增强,伴有SREBP-1c下降;2.胰岛素上调OA诱导的H4IIE细胞SREBP-1c蛋白及m RNA水平,增加细胞脂质含量,降低细胞自噬水平及自噬功能;雷帕霉素下调OA诱导的H4IIE细胞SREBP-1c蛋白及m RNA水平,降低细胞脂质含量,提高细胞自噬水平及自噬功能;3.过表达SREBP-1c使OA诱导的H4IIE细胞脂质含量增加,自噬水平及自噬功能下降;转染SREBP-1c-si RNA使OA诱导的H4IIE细胞脂质含量降低,自噬水平及自噬功能升高;4.高浓度OA引起H4IIE细胞脂性凋亡及自噬性凋亡,p53、Bax、caspase3蛋白水平升高,p53抑制剂Pftα可抑制OA诱导的脂性凋亡,提示OA引起的H4IIE细胞脂性凋亡是p53依赖的;5.过表达SREBP-1c可降低OA诱导的H4IIE细胞凋亡率及其caspase3的蛋白水平,可进一步降低自噬溶酶体抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)导致的细胞凋亡;转染SREBP-1c-si RNA的实验结果进一步证实了上述结论,提示SREBP-1c可抑制OA引起的H4IIE细胞脂性凋亡及自噬性凋亡;6.转染SREBP-1c-si RNA可提高OA诱导的细胞凋亡相关蛋白p53、Bax水平;Pftα可抑制OA诱导的细胞凋亡率及Bax水平;转染SREBP-1c-si RNA可逆转Pftα对OA诱导的细胞凋亡的影响,提示SREBP-1c对OA诱导的H4IIE细胞脂性凋亡的抑制部分依赖于p53-Bax通路;7.NAFLD大鼠肝脏SREBP-1c升高;LC3、P62升高,表明自噬功能下降;且SREBP-1c与LC3、P62呈正相关,提示SREBP-1c可能抑制NAFLD大鼠肝脏自噬功能。8.与单纯DEN处理组比较,DEN+高脂组大鼠肝细胞脂肪变性、气球样变、伴有炎性细胞浸润及小灶性坏死;GST-π表达水平增高;SREBP-1c、FAS、ACC、SCD1表达水平上升;p-AMPK水平下降。提示SREBP-1c可能参与大鼠脂肪肝相关性肝癌前病变的形成。9.AMPK通过抑制SREBP-1c的表达水平降低PA诱导的H4IIE细胞内脂质合成。结论:1.OA可以诱导H4IIE细胞发生脂性自噬;SREBP-1c可抑制OA诱导的脂性自噬。2.OA可以诱导H4IIE细胞发生脂性凋亡;SREBP-1c可抑制OA诱导的脂性凋亡及自噬性凋亡;SREBP-1c对OA诱导的脂性凋亡的抑制作用部分依赖于p53-Bax信号通路。3.NAFLD大鼠肝脏自噬功能下降,SREBP-1c可能通过抑制自噬功能参与大鼠NAFLD发生。4.AMPK可能通过抑制SREBP-1c的表达水平参与大鼠脂肪肝相关性肝癌前病变的形成。
【关键词】：固醇调节元件结合蛋白1c 脂性自噬 脂性凋亡 非酒精性脂肪肝病 脂肪肝相关性肝癌/肝癌前病变
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-13
• 实验材料13-22
• 实验方法22-35
• 实验结果35-57
• 讨论57-62
• 结论62
• 参考文献62-70
• 综述70-90
• 参考文献76-90
• 附录90-91
• 攻读学位期间发表文章情况91-92
• 致谢92-93
• 个人简历93

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本文编号：814375