IGF-Ⅰ对肝硬化大鼠肠粘膜屏障保护作用的研究

发布时间：2017-09-09 08:49

  本文关键词：IGF-Ⅰ对肝硬化大鼠肠粘膜屏障保护作用的研究

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【摘要】：失代偿期肝硬化是各种慢性肝病的终末期阶段。我国是乙型肝炎大国,慢性乙型肝炎仍是我国肝硬化的主要病因。食管胃底静脉曲张破裂出血、自发性腹膜炎、肝性脑病、肝肾综合征及肝肺综合征是肝硬化失代偿期的常见并发症,这些并发症严重时可以导致患者死亡。肝硬化并发症的主要病理生理基础为肝功受损及门脉高压(portal hypertension,PH)。因此,阐明肝功受损及PH发生和发展机制具有重要的临床意义,这有助于发现新的治疗方案,并最终提高患者的生存率。肠粘膜屏障(intestinal barrier,IB)包括机械屏障、化学屏障、生物屏障及免疫屏障等,可以有效阻止肠道内有害物质过多进入血液循环,具有重要的保护功能。研究表明肝硬化可以引起IB通透性增加,导致肠道内毒素进入血循环增加及细菌移位。内毒素血症及菌群移位诱导单核细胞释放炎症因子增加,引起肝脏损害及PH。同时研究还表明IB受损不仅是肝硬化发生及发展的结果,IB受损还是肝损伤及PH发展的主动参与者。IB受损导致肠道细菌移位及肠道对包括脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在内的毒素通透性增加,LPS诱导门脉及肝血窦中单核细胞释放炎症因子增加。这些炎症因子进一步诱导一氧化氮合成酶表达增加,一氧化氮过表达导致门脉系统的高循环状态,促进门脉高压的发生与发展。门脉中的炎症因子还可以损害肠黏膜,加剧IB受损。可见内毒素血症及IB受损构成了一个恶性循环,两者相互影响,相互促进。阻止这一恶性循环将有助于减轻肝脏损伤及减轻门脉高压,具有重要的临床意义。胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)是一种具有胰岛素样结构的多肽,其受体广泛分布于肌肉、骨骼、肠道及肝脏等组织。igf-Ⅰ除了具有促进生长及营养作用外,igf-Ⅰ还可以调节ib功能。研究表明igf-Ⅰ可以通过增加环氧酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)的表达及降低肿瘤坏死因子(tunmornecrosisfactor,tnf)的表达减轻ib通透性。推测igf-Ⅰ是通过cox-2的细胞保护作用及抑制炎症来改善ib功能。研究还表明igf-Ⅰ还具有上调成骨样细胞系mc3t3-e1紧密连接蛋白表达及降低间充质干细胞凋亡的作用。然而,igf-Ⅰ是否同样可以通过上调肠细胞紧密连接蛋白及抑制肠上皮细胞凋亡来增加ib功能并不清楚。本研究旨在通过肝硬化动物模型阐明ib、igf-Ⅰ及内毒素在肝硬化发展过程中的变化,了解igf-Ⅰ对肝硬化动物ib功能的影响,并明确igf-Ⅰ是否通过调节肠道紧密连接蛋白及肠上皮细胞凋亡而增加ib功能;通过细胞模型验证igf-Ⅰ在动物模型中的作用机制;通过肝硬化患者分析igf-Ⅰ与肝功严重程度的相关性,为igf-Ⅰ的临床应用及寻找新的肝硬化治疗靶点提供理论依据。本研究共分三部分第一部分igf-Ⅰ对肝硬化大鼠肠粘膜屏障保护作用机制的研究第二部分igf-Ⅰ对lps损伤caco-2细胞通透性影响及机制的研究第三部分肝硬化患者igf-Ⅰ与肝功严重程度的相关性分析第一部分igf-Ⅰ对肝硬化大鼠肠粘膜屏障保护作用的研究目的:研究外源性补充igf-Ⅰ对肝硬化大鼠肠紧密连接蛋白occludin和claudin-1表达的调节,研究igf-Ⅰ对肝硬化大鼠门脉中igf-Ⅰ及内毒素的影响,研究igf-Ⅰ对肝硬化大鼠肠上皮细胞凋亡的作用。探讨研究外源性igf-Ⅰ对肝硬化大鼠ib保护作用的机制。方法:1.将30只健康成年雄性sprague-dawley大鼠随机分为对照组、模型组及模型治疗组。模型组腹腔内注射四氯化碳(0.2ml/kg/d)6周诱导大鼠肝硬化模型,对照组腹腔内注射生理盐水(0.2ml/kg/d)6周。模型治疗组腹腔内注射四氯化碳(0.2ml/kg/d)6周,后皮下注射重组人igf-Ⅰ(0.2μg/kg/d)21天。2.给药结束后,禁食水24h,对三组大鼠进行门静脉压力测定。留取门脉血液、肝组织及盲肠。3.应用试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平。4.应用酶联免疫吸附试验测定血清igf-Ⅰ水平,采用鲎试验检测血浆内毒素水平。对肝组织进行he染色及masson染色,观察肝脏组织形态,并应用imageproplus软件对肝纤维化进行定量分析。5.通过westernblot及rt-pcr方法观察大鼠盲肠中occludin和claudin-1蛋白及基因表达情况。6.应用tunel法检测盲肠细胞凋亡情况,并应用rt-pcr检测盲肠凋亡基因bax及bcl-2的表达情况。结果:1.he及masson染色显示,于6周时肝硬化组大鼠发生肝硬化,表明造模成功。2.模型治疗组肝纤维化程度明显低于模型组(p0.01)。3.肝硬化组门脉压力明显高于对照组(p0.001),模型治疗组门脉压力明显低于模型组(p0.001)。4.肝硬化组血清alt及ast水平明显高于对照组(p0.001)。模型治疗组血清alt及ast水平明显低于模型组(p0.001)。5.肝硬化组门脉血清igf-Ⅰ明显低于对照组(p0.001),模型治疗组门脉血清igf-Ⅰ明显高于模型组(p0.001);肝硬化组门脉血浆内毒素水平明显高于对照组(p0.001),模型治疗组门脉血浆内毒素明显低于模型组(p0.001)。6.肝硬化组盲肠中occludin(p0.001)和claudin-1(p0.001)蛋白表达及基因表达均低于对照组。模型治疗组盲肠中occludin(p0.001)和claudin-1(p0.001)蛋白表达及基因表达均高于模型组。7.tunel表明,模型组凋亡水平明显高于对照组(p0.001),模型治疗组凋亡水平明显低于模型组(p0.001)。模型组bax基因表达明显高于对照组(p0.001),模型治疗组bax基因表达明显低于模型组(p0.001);模型组bcl-2基因表达明显低于对照组(p0.001),模型治疗组bcl-2基因表达明显高于模型组(p0.001)。结论:外源性补充IGF-Ⅰ在一定程度上恢复了肝硬化大鼠血中IGF-Ⅰ水平,改善肝硬化大鼠肠粘膜屏障功能,降低内毒素水平,进而改善肝功能,降低门脉压力,减轻肝纤维化。第二部分IGF-Ⅰ对LPS损伤Caco-2细胞通透性影响及机制的研究目的:考察外源性IGF-Ⅰ对Caco-2单层细胞通透性的影响,并探讨IGF-Ⅰ对Caco-2单层细胞紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1表达的调节作用,观察IGF-Ⅰ对Caco-2单层细胞凋亡的影响,进一步印证动物实验结论。方法:1.Caco-2单层细胞模型建立及及细胞分组:应用高糖DMEM培养人结直肠腺瘤细胞系Caco-2细胞。给药前,取对数生长期的Caco-2细胞接种于6孔板,并应用无血清DMEM培养基培养24小时。细胞分为四组:LPS组应用LPS(10μg/ml)作用细胞24小时;IGF-Ⅰ组应用IGF-Ⅰ(100ng/ml)作用细胞24小时;LPS+IGF-Ⅰ组应用LPS(10μg/ml)及IGF-Ⅰ(100ng/ml)同时作用细胞24小时;不给药组为对照组,每组设6个重复孔。2.应用跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)测量各组单层细胞的通透性。3.通过western blot及RT-PCR方法观察Caco-2单层细胞中Occludin和Claudin-1蛋白及基因表达情况。4.应用TUNEL法检测不同处理组单层细胞凋亡情况,并应用RT-PCR检测Caco-2单层细胞凋亡基因Bax及Bcl-2的表达情况。结果:1.IGF-Ⅰ组TEER明显高于对照组(P0.001),LPS+IGF-Ⅰ组TEER明显高于LPS组(P0.001)。2.IGF-Ⅰ组Occludin(P0.001)和Claudin-1(P0.001)蛋白表达明显高于对照组,IGF-Ⅰ组Occludin(P0.001)和Claudin-1(P0.001)基因表达表达明显高于对照组。LPS+IGF-Ⅰ组Occludin(P0.001)和Claudin-1(P0.001)蛋白表达明显高于LPS组,LPS+IGF-Ⅰ组Occludin(P0.001)和Claudin-1(P0.001)基因表达表达明显高于LPS组。3.TUNEL表明,IGF-Ⅰ组凋亡水平明显低于对照组(P0.001),LPS+IGF-Ⅰ组凋亡水平明显低于LPS组(P0.001)。4.IGF-Ⅰ组Bax基因表达水平明显低于对照组(P0.001),LPS+IGF-Ⅰ组Bax基因表达水平明显低于LPS组(P0.001)。IGF-Ⅰ组Bcl-2基因表达水平明显高于对照组(P0.001),LPS+IGF-Ⅰ组Bcl-2基因表达水平明显高于LPS组(P0.001)。结论:外源性IGF-Ⅰ可以增加Caco-2单层细胞紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1表达,并下调Caco-2单层细胞凋亡水平,进而降低Caco-2单层细胞通透性。第三部分肝硬化患者IGF-1与肝功严重程度的相关性分析目的:分析肝硬化患者胰岛素样生长因子Ⅰ与肝功严重程度的相关性。方法:1.收集2014年8月至2015年3月在大连医科大学附属第一医院住院治疗诊断为肝硬化患者101例。根据肝功能Child-Push分级及评分标准分为三组,A组(A级,5-6分)、B组(B级,7-9分)、C组(C级,10-15分)。根据MELD评分标准分为三组,D组(≤11分)、E组(11-18分)、F组(≥18)。2.收集患者住院后的首次检验检查指标,检测血清白蛋白(Albumin,ALB)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、肌酐(Creatinine,肌酐)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、国际标准化比率(international normalized radio,INR)。应用酶联免疫吸附实验测定血清IGF-Ⅰ水平。结果:1.在肝硬化的病因中,既往有饮酒史占总人数的14.85%;病毒性肝炎占总人数的52.48%;自身免疫性肝病占总人数的23.76%;其他原因者占总人数的8.91%。在失代偿患者中,出现腹腔积液的占总人数的58.42%,出现自发性腹膜炎的占总人数的11.88%,出现消化道出血的占总人数的31.68%,出现肝性脑病的占总人数的48.51%。2.IGF-Ⅰ与Child-Pugh评分、MELD评分、凝血酶原时间、总胆红素及INR均呈明显负相关,IGF-Ⅰ与血清白蛋白呈明显正相关,IGF-Ⅰ与患者的肾功能无相关性。3.Child Pugh分级越高,IGF-Ⅰ的水平就越低。在A组、B组、C组之间进行两两比较时发现,A组与B组、C组比较,P值均小于0.001,说明A组与B组、C组之间差异显著。而在B组和C组之间比较时,P值为0.327,没有统计学意义,说明在B组和C组之间,IGF-Ⅰ水平没有差异。4.MELD分数越高,IGF-Ⅰ的水平就越低。在D组、E组、F组之间进行两两比较时发现,D组与E组、F组比较,P值均小于0.001,说明D组与E组、F组之间差异显著。而在E组和F组之间比较时,P值为0.658,没有统计学意义,说明在E组和F组之间,IGF-Ⅰ水平没有差异。结论:本文论证了IGF-Ⅰ与Child-Push分级、MELD评分、评价肝功能的主要指标均有相关性,故IGF-Ⅰ可以作为评估肝脏功能的一项重要指标。
【关键词】：紧密连接蛋白 门脉高压 胰岛素样生长因子 凋亡 内毒素 紧密连接蛋白 脂多糖 跨膜电阻 胰岛素样生长因子 凋亡 胰岛素样生长因子 肝硬化
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-22
• 第一部分 IGF-Ⅰ对肝硬化大鼠肠粘膜屏障保护作用的研究22-44
• 前言22-23
• 材料和方法23-36
• 1. 主要试剂23-24
• 2.主要仪器24
• 3.实验方法24-36
• 3.1 动物分组24-25
• 3.2 模型制备及给药25
• 3.3 CCL4大鼠模型制备成功的验证及标本采集25-26
• 3.4 检测指标及方法26-35
• 3.5 统计学处理35-36
• 结果36-40
• 1.大鼠肝硬化模型的建立36
• 2. 生化指标测定结果36-37
• 3. 肝组织病理学37-38
• 4. 门脉压力的测定和血浆内毒素的测定38
• 5.大鼠盲肠上皮细胞Occludin、Claudin-1 的表达38-39
• 6.大鼠盲肠上皮细胞凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2 的表达39-40
• 讨论40-43
• 总结43-44
• 第二部分 IGF-Ⅰ对LPS损伤Caco-2 细胞通透性影响及机制的研究44-59
• 前言44-45
• 材料和方法45-52
• 1.主要试剂45-46
• 2.主要仪器46-47
• 3.实验方法47-52
• 3.1 细胞分组47
• 3.2 模型的制备及给药47-50
• 3.3 检测指标及方法50-52
• 3.4 统计学处理52
• 结果52-55
• 1.Caco-2 细胞单层模型的建立52-53
• 2.LPS和IGF-Ⅰ对Caco-2 细胞TEER的影响53
• 3.Occludin、Claudin-1 在肠上皮细胞紧密连接中的表达53-54
• 4.Caco-2 细胞凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2 的表达54-55
• 讨论55-58
• 总结58-59
• 第三部分 肝硬化患者IGF-Ⅰ与肝功严重程度的相关性分析59-73
• 前言59-60
• 对象和方法60-64
• 1.研究对象60-61
• 2. 研究方法61-63
• 2.1 实验分组61
• 2.2 检测指标及检测方法61-63
• 3.统计学处理63-64
• 结果64-67
• 1.患者的一般资料64
• 2. I G F -Ⅰ与各项指标的相关性64-66
• 3.IGF -Ⅰ与肝功严重程度比较66-67
• 讨论67-72
• 总结72-73
• 结论73-74
• 参考文献74-85
• 综述85-97
• 参考文献93-97
• 攻读学位期间发表文章及获奖情况97-98
• 致谢98-99

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