脂肪酸体外通过诱导肝细胞内质网应激抑制HBV复制及HBsAg分泌
本文关键词：脂肪酸体外通过诱导肝细胞内质网应激抑制HBV复制及HBsAg分泌
更多相关文章： 内质网应激 HepG2.2.15细胞 硬脂酸 油酸 非酒精性脂肪性肝病 HBV DNA HBsAg GRP78
【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染合并非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)越来越多见,然而脂肪性肝病对HBV复制和相关抗原分泌的影响及其机制目前不清楚。肝细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是参与多种肝脏疾病中常见的病理生理过程。为了解脂肪性肝病对HBV DNA复制及HBsAg分泌的影响,本研究通过建立慢性HBV感染合并脂肪性肝病细胞模型,初步探讨脂肪酸对HBV复制的影响及其机制。方法:以HBV稳定转染人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞为研究对象,用硬脂酸(stearic acid,SA)、油酸(oleic acid,OA)诱导细胞发生脂肪变性,应用MTS法检测SA、OA对细胞增殖活力的影响,应用油红O-苏木精染色观察细胞内脂滴形成情况,GPO-PAP法检测细胞内甘油三酯(triglyceride,TG)含量,确定慢性HBV感染合并脂肪性肝病细胞模型的建立。应用Western Blotting(WB)技术检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP 78)、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、胆固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1c)的表达及磷酸化水平来判断细胞ER stress;应用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测培养上清HBV DNA载量、酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测细胞培养上清HBsAg、HBeAg水平来判断HBV复制水平。进一步分别用4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA)及GRP78小干扰RNA(small interfering RNA,GRP78 siRNA)减轻ER stress及阻断GRP78表达,观察脂肪酸对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响。结果:1、SA和OA诱导HepG2.2.15细胞发生脂肪变性。100μM SA及0.2mM OA分别作用于HepG2.2.15细胞后,随着时间的延长,细胞内脂滴增多增大,并出现融合现象;细胞内TG的合成也显著增加。成功构建了慢性HBV感染合并脂肪性肝病细胞模型。2、SA和OA诱导HepG2.2.15细胞ER stress。用50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA分别作用于HepG2.2.15细胞48h后,GRP 78表达均显著增加;100μM SA及0.2mM OA作用于HepG2.2.15细胞后,GRP 78表达水平、PERK及eIF2α磷酸化水平、SREBP1c表达水平从24h至72h时间依赖性增加。以上结果证实SA及OA时间及浓度依赖性诱导HepG2.2.15细胞ER stress。3、SA和OA抑制HepG2.2.15细胞HBsAg分泌。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA在48h浓度依赖性抑制HepG2.2.15细胞HBsAg分泌;200μM SA时显著抑制HBeAg分泌;100μM SA和0.2mM OA分别作用于HepG2.2.15细胞24h至72h后,细胞外HBsAg分泌显著降低,HBeAg分泌也有下降但无统计学意义。以上结果证实SA及OA时间及浓度依赖性抑制HepG2.2.15细胞HBsAg分泌。4、SA和OA抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA复制。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA作用于HepG2.2.15细胞48h,细胞外HBV DNA水平浓度依赖性降低;100μM SA和0.2mM OA分别作用于HepG2.2.15细胞后,从24h至72h细胞外HBV DNA水平显著降低。以上结果证实SA及OA时间及浓度依赖性抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA复制。5、脂肪酸体外通过诱导ER stress抑制HepG2.2.15细胞HBsAg分泌和HBV DNA复制。用PBA减轻SA和OA诱导的HepG2.2.15细胞ER stress后,HBsAg分泌及HBV DNA复制水平显著增加。以上结果说明脂肪酸通过诱导HepG2.2.15细胞ER stress抑制HBV复制及HBsAg分泌。6、GRP78 siRNA对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响。首先发现GRP78 siRNA显著抑制SA诱导的GRP78表达,但我们观察到用GRP78 siRNA抑制GRP78表达后,SA对HBsAg分泌及HBV DNA的抑制作用并未减轻,说明脂肪酸可能并不通过诱导GRP78表达抑制HBsAg的分泌和HBV DNA复制。结论:脂肪酸体外通过诱导肝细胞ER stress抑制HBsAg分泌和HBV DNA复制,初步结果表明这种抑制作用可能不是通过诱导GRP78表达来实现的。
【关键词】：内质网应激 HepG2.2.15细胞 硬脂酸 油酸 非酒精性脂肪性肝病 HBV DNA HBsAg GRP78
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62;R575
【目录】：
- 中英缩略词表4-6
- 中文摘要6-8
- Abstract8-10
- 前言10-13
- 1 材料与方法13-27
- 1.1 主要实验材料13-14
- 1.2 主要实验试剂14-15
- 1.3 实验方法15-26
- 1.4 统计学方法26-27
- 2 结果27-51
- 2.1 HepG2.2.15 细胞脂肪变性模型的建立27-31
- 2.2 脂肪酸诱导 Hep G2.2.15 细胞 ER stress31-35
- 2.3 SA 和 OA 对 Hep G2.2.15 细胞 HBs Ag、HBe Ag 分泌的影响35-40
- 2.4 SA 及 OA 对 Hep G2.2.15 细胞 HBV DNA 复制的影响40-42
- 2.5 SA 及 OA 通过诱导 Hep G2.2.15 细胞 ER stress 抑制 HBs Ag、HBe Ag 分泌及 HBVDNA 复制42-47
- 2.6 GRP 78 si RNA 干预对 Hep G2.2.15 细胞 HBV 复制的影响47-51
- 3 讨论51-55
- 4 结论55-56
- 参考文献56-61
- 综述61-70
- 参考文献66-70
- 致谢70-71
- 作者简介71
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，本文编号：838958
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