SATB1在肝星状细胞活化和大鼠肝纤维化形成中作用机制的研究

发布时间：2017-09-13 19:01

  本文关键词：SATB1在肝星状细胞活化和大鼠肝纤维化形成中作用机制的研究

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【摘要】：[研究背景与目的] 肝星状细胞活化是肝纤维化的中心环节。既往研究表明,TGF-β1和MAPK信号通路的异常激活与肝星状细胞活化及肝纤维化发展密切相关。SATB1是一种核基质结合蛋白,调控超过1000种基因的转录及表达；其参与介导TGF-β1及MAPK等重要细胞信号转导通路,并影响细胞增殖、凋亡、迁移等生物学过程。但目前关于SATB1在肝星状细胞活化及肝纤维化形成中的作用尚无研究报道。因此,我们拟在体外细胞水平研究SATB1对肝星状细胞活化、增殖、迁移和粘附的影响及其机制,以及在体内动物水平研究SATB1对大鼠肝纤维化形成的影响,探索SATB1在肝星状细胞活化及肝纤维化形成中的作用及机制。 [方法] 利用硫代乙酰胺建立肝纤维化大鼠模型；免疫组织化学、激光共聚焦、real-time PCR和Western blot检测正常及纤维化大鼠肝组织中SATB1和a-SMA的表达定位及含量变化。建立大鼠肝星状细胞活化体内及体外模型,real-timePCR和Western blot检测SATB1和a-SMA的表达变化。利用siRNA及SATB1真核表达质粒(或SATB1腺病毒表达载体)建立SATB1低表达和过表达肝星状细胞株(人肝星状细胞株LX-2和大鼠HSCs)。 Real-time PCR和Western blot法检测SATB1表达变化对HSCs活化相关因子a-SMA、CTGF、COL1A1、COL3A1的影响。CCK-8及real-time PCR法检测SATB1表达变化对LX-2细胞增殖能力及cyclin D1、 cyclin El的影响。Transwell细胞迁移小室及细胞粘附实验检测SATB1表达变化对LX-2细胞迁移和粘附能力的影响。Real-time PCR和Western blot法初步筛选SATB1可能影响的细胞信号通路,包括：TGF-β1信号通路(TGF-β1, Smad2、 Smad3、 Smad4和Smad7)、 MAPK信号通路(Ras、 Raf-1、 MEK、 ERK、 JNK、 P38)以及转录因子(Smad4和Ets-1)。利用信号通路抑制剂ManumycinA (Ras)、 GW5074(Raf-1)、 U0126和PD98059(MEK/ERK)以及Ets-1siRNA处理LX-2细胞(NC和siSATB1-1),进一步验证SATB1调控CTGF的信号通路。Real-time PCR法检测Ras GTP酶激活蛋白表达变化,筛选SATB1调控Ras激活的基因。硫代乙酰胺法建立肝纤维化大鼠模型,造模5周后将SATB1重组腺病毒经尾静脉导入大鼠体内,造模7周后HE、Masson及SiriusRed染色观察肝组织病理改变及胶原沉积,测定肝功能(ALT和AST)评估肝损伤程度,测定羟辅氨酸评估肝内胶原含量变化；免疫组化、real-time PCR及Western blot法检测a-SMA、CTGF、 COLlA1的表达定位及含量变化。 [结果] SATB1在肝星状细胞中表达并定位于细胞核；在肝星状细胞体内及体外活化过程中,随着肝星状细胞活化程度的增加,其表达下降(p0.05)。抑制SATB1表达可上调HSCs活化相关基因a-SMA、 CTGF、 COLlAl (p0.05),促进LX-2细胞增殖并上调cyclinE1,以及促进LX-2细胞迁移(p0.05)。反之,增强SATB1表达则发挥与上述相反的作用(p0.05)。SATB1表达变化对LX-2细胞粘附能力无明显影响(p0.05)。抑制SATB1表达,对TGF-β1信号通路中TGF-β1、 Smad2、 Smad3、 Smad4及Smad7的mRNA水平,以及Smad3磷酸化和Smad4核转位无明显影响；但可激活Ras,继而诱导Raf-1向胞膜聚集,提高MEK、ERK以及Ets-1磷酸化水平。反之,增强SATB1表达则显著抑制Ras/Raf/MEK/ERK/Ets-1信号通路。此外,用Ras、 Raf-1、 MEK、 ERK通路蛋白抑制剂和Ets-1siRNA处理LX-2-siSATB1-1细胞,可有效抑制过度激活的Ras、Raf-1、 MEK、 ERK、 Ets-1,从而减弱或消除由SATB1下调所引起的CTGF表达上调。在动物实验中,与PBS组和AdGFP导入组相比,AdSATB1导入组大鼠肝组织中纤维间隔及汇管区内胶原沉积明显减少,羟辅氨酸含量降低,肝功能有所改善,α-SMA、 CTGF和COLlA1的表达水平不同程度下降(p0.05)。 [结论] 在活化的肝星状细胞中,SATB1表达水平下降；SATB1下调后激活Ras/Raf/MEK/EKR/Ets-1信号通路,诱导促纤维化因子CTGF、 HSCs活化标志性蛋白a-SMA和Ⅰ型胶原(COLlA1)的表达上调,并促进HSCs增殖及迁移。在肝纤维化大鼠模型内,过表达SATB1可改善肝功能、减少肝内胶原沉积及下调a-SMA, CTGF和COL1A1的表达。体内外实验研究表明：SATB1抑制肝星状细胞活化及阻碍肝纤维化进程,这为研究肝纤维化发生发展的机制提供一个新的思路。
【关键词】：肝纤维化 肝星状细胞 活化 增殖 迁移 SATB1 Ras信号通路
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-17
• 第一部分 SATB1与肝纤维化及肝星状细胞活化的相关性研究17-48
• 摘要17-18
• 前言18-19
• 材料和方法19-36
• 结果36-39
• 讨论39-42
• 附图42-48
• 第二部分 SATB1参与肝星状细胞活化过程的研究48-75
• 中文摘要48-49
• 前言49-50
• 材料与方法50-61
• 结果61-64
• 讨论64-67
• 附图67-75
• 第三部分 SATB1调控促纤维化因子CTGF的信号转导机制75-96
• 中文摘要75-76
• 前言76-77
• 材料和方法77-82
• 结果82-84
• 讨论84-87
• 附图87-96
• 第四部分 腺病毒介导的SATB1表达对肝纤维化大鼠的影响96-114
• 中文摘要96-97
• 前言97
• 材料和方法97-104
• 结果104-107
• 讨论107-110
• 附图110-114
• 全文总结114-116
• 参考文献116-127
• 综述127-144
• 参考文献137-144
• 英文缩略词表144-146
• 博士期间发表的文章146-147
• 致谢147

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本文编号：845322