TRPV4对大鼠HSC-T6细胞的作用探究

发布时间：2017-09-14 06:04

  本文关键词：TRPV4对大鼠HSC-T6细胞的作用探究

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【摘要】：肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是肝脏对酒精、药物、病毒感染、自身免疫失衡等细胞损伤因素而产生的一种可逆的愈合反应,为慢性肝病共有的病理改变,主要表现为以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内大量沉积并伴有肝脏损伤,如果不加以控制,肝纤维化可发展为肝硬化甚至肝癌,严重威胁人类健康。探讨肝纤维化形成过程中的机制对慢性肝病的治疗具有重要的意义。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)与肝纤维化发生发展过程存在着密切的联系,HSCs细胞的激活对肝纤维化的形成有着重要的作用。激活的HSCs细胞转化形为肌成纤维细胞(Myofibroblast-like cells,MFBLC),并分泌大量的胶原,最终导致肝纤维的形成。作为肝纤维化发生的主要效应细胞之一,促进增殖的HSCs发生凋亡已成为防治肝纤维化有效途径。大量研究证实,自噬(Autophagy)在肝纤维化形成过程中发挥着重要的作用,自噬与HSCs细胞的凋亡也存在密切的联系。同时,研究表明,HSCs细胞的激活能够促进细胞钙离子(Ca2+)内流,抑制HSCs细胞Ca2+内流对促进活化的HSCs细胞发生凋亡具有重要的意义。并且,研究证实Ca2+浓度的变化对细胞自噬也起着重要的调节作用。课题组前期研究证实,非选择性Ca2+瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(Transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)在肝纤维化形成中发挥着重要的作用。本课题重点研究TRPV4对大鼠HSC-T6的作用,为肝纤维化的治疗提供新的靶点。主要研究内容概括如下:1.TRPV4在大鼠肝星状细胞中的表达情况及对大鼠肝星状细胞凋亡蛋白的影响实验采用大鼠HSC-T6细胞系为研究对象,用浓度为10ng/ml TGF-?1处理细胞24h,实时定量PCR(qRT-PCR)、Western blot检测TRPV4的mRNA和蛋白的表达水平,检测结果显示,与未处理组相比,TGF-?1处理后,TRPV4的mRNA和蛋白水平明显升高。提示TRPV4在大鼠HSC-T6细胞中增殖、活化过程中可能发挥着重要的作用。采用lipofectaminetm2000介导的sirna技术特异性沉默大鼠hsc-t6细胞内trpv4,首先通过流式细胞技术观察大鼠hsc-t6细胞凋亡情况,并采用qrt-pcr、westernblot检测bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平。qrt-pcr、westernblot结果显示,与tgf-?1处理组相比,特异性阻断trpv4的表达,可明显提高bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平。流式结果显示,与tgf-?1处理组相比,特异性阻断trpv4的表达,可明显促进大鼠hsc-t6细胞凋亡蛋白的表达。与之相应的,通过trpv4的特异性激动剂1um4α-pdd激活trpv4,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平明显下降。提示,在细胞活化的过程中,trpv4可以抑制凋亡蛋白的表达,可能起到调控细胞凋亡的作用。2.自噬在大鼠hsc-t6细胞中的水平及trpv4对自噬水平的影响机制研究qrt-pcr、westernblot检测显示,与未处理组相比,tgf-?1处理后,lc3的mrna和蛋白水平明显升高,p62的mrna和蛋白水平明显降低。特异性阻断trpv4,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,lc3的mrna和蛋白水平明显降低,p62的mrna和蛋白水平明显升高,吖啶橙染色结果显示,自噬小泡明显减少。激活trpv4后,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,lc3的mrna和蛋白水平明显升高,p62的mrna和蛋白水平明显降低,吖啶橙染色结果显示,自噬小泡明显减少。为了进一步研究trpv4对自噬的调节机制,大量文献证实,akt通路是自噬的经典上游通路。通过特异性阻断trpv4,westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,p-akt蛋白表达水平明显降低。以上结果提示,在细胞活化的过程中,trpv4可能是通过激活akt通路继而上调自噬。3.在大鼠hsc-t6细胞中自噬对凋亡蛋白表达的影响使用自噬抑制剂氯喹抑制自噬的水平,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平明显升高。提示在大鼠hsc-t6细胞中,抑制自噬水平可明显促进凋亡蛋白的表达。为了进一步探讨TRPV4与自噬和凋亡蛋白变化之间的关系。我们发现,在抑制自噬的基础上激活TRPV4,与TRPV4不处理组比较,凋亡蛋白没有明显的变化。证实TRPV4可能是通过激活自噬进而抑制凋亡凋亡蛋白的表达。
【关键词】：瞬时受体电位V4通道 肝星状细胞 自噬 凋亡蛋白 AKT信号通路
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中英文缩略词对照7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-15
• 1. 前言15-17
• 2. 实验材料17-21
• 2.1 药品与试剂17-18
• 2.2 仪器与设备18-19
• 2.3 溶液和试剂的配制19-21
• 3. 实验方法21-31
• 3.1 细胞培养21-22
• 3.1.1 细胞复苏21
• 3.1.2 细胞培养21
• 3.1.3 细胞传代21-22
• 3.1.4 细胞计数22
• 3.1.5 细胞冻存22
• 3.2 细胞转染22-23
• 3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)23-26
• 3.3.1 HSC-T6细胞总RNA的提取23-24
• 3.3.2 cDNA的合成24-25
• 3.3.3 提取的细胞cDNA用于qRT-PCR25-26
• 3.4 MTT比色法测细胞增殖26
• 3.5 吖啶橙染色检测细胞自噬26-27
• 3.6 流式细胞术检测细胞细胞凋亡27
• 3.7 Western Blot27-30
• 3.7.1 细胞总蛋白制备和定量27
• 3.7.2 蛋白质电泳27-29
• 3.7.3 半干转29
• 3.7.4 电转移（湿转）29
• 3.7.5 抗原抗体反应及显色29-30
• 3.7.6 结果分析30
• 3.8 统计学分析30-31
• 4. 实验结果31-53
• 4.1 TRPV4在TGF-β1诱导的HSC-T6细胞中的表达变化31-32
• 4.2 TRPV4对HSC-T6凋亡蛋白表达的影响32-40
• 4.2.1 转染si-TRPV4后对HSC-T6凋亡蛋白表达的作用32-36
• 4.2.2 促进TRPV4表达对HSC-T6凋亡蛋白表达的影响36-40
• 4.3 自噬水平在TGF-β1诱导的HSC-T6细胞中的变化40-41
• 4.4 TRPV4对HSC-T6细胞自噬的作用41-46
• 4.4.1 转染TRPV4 siRNA后对HSC-T6自噬水平的作用41-44
• 4.4.2 刺激TRPV4后对HSC-T6自噬的影响44-46
• 4.5 自噬对HSC-T6细胞凋亡蛋白表达的影响46-50
• 4.6 TRPV4通过调节自噬进而抑制凋亡的表达50-51
• 4.7 沉默TRPV4对HSC-T6细胞中p-AKT表达的影响51-53
• 5. 讨论53-56
• 结论56-57
• 参考文献57-62
• 附录62-64
• 致谢64-65
• 综述65-86
• References76-86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 梁一晨;吴红革;薛红建;刘青;石亮亮;刘涛;伍钢;;Effects of PI3K Inhibitor NVP-BKM120 on Acquired Resistance to Gefitinib of Human Lung Adenocarcinoma H1975 Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年06期

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本文编号：848292