角蛋白1转基因小鼠建系及其在小鼠实验性结肠炎中的作用研究

发布时间：2017-09-14 11:00

  本文关键词：角蛋白1转基因小鼠建系及其在小鼠实验性结肠炎中的作用研究

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【摘要】：[背景]溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)是一种肠道慢性非特异性炎症性疾病。病变多起自直肠,逐渐向近端发展,并可累及全结肠。症状反复发作、迁延不愈,给患者的生活带来巨大影响。目前其确切的病因、发病机制仍不明确。本课题组前期通过基因芯片、双向凝胶电泳及质谱分析等系列研究筛选出UC患者差异表达的基因和蛋白质,发现角蛋白1(Keratin 1,KRT1)在基因及蛋白水平均表达下调,随后免疫组化结果也证实KRT1在UC患者肠黏膜中表达减少,且与疾病严重程度呈负相关,但至今KRT1在UC发生发展中的具体机制仍不明确。本研究拟采用转基因小鼠DSS肠炎模型探讨KRT1与UC炎症的关系,以期初步阐明KRT1在UC中的作用。[目的]建立KRT1杂合子转基因小鼠,构建葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate, DSS)诱导的小鼠实验性结肠炎模型,从动物水平探讨KRT1对UC炎症的影响。[方法]1、KRT1转基因小鼠建系：采用DNA原核显微注射的方法构建KRT1转基因小鼠,采用经典育种与PCR相结合的方法对转基因(Transgenic mice, TG)小鼠进行筛选,建立KRT1杂合子转基因小鼠。2、分组：选择7-8周雄性C57BL/6野生型(Wild-type,WT)小鼠及KRT1杂合子转基因小鼠作为实验动物,随机分组为KRT1转基因小鼠模型组(TG DSS)、野生型小鼠模型组(WT DSS)、KRT1转基因小鼠对照组(TG control)、野生型小鼠对照组(WT control),每组15只。3、模型构建：模型组小鼠自实验第一天凌晨开始自由饮用4%DSS,对照组小鼠同一时间点开始自由饮用高压灭菌蒸馏水,实验第八天上午乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死各实验组小鼠。4、观察实验过程中小鼠精神、饮食、体重及疾病活动指数变化。5、对比各实验组小鼠结肠及脾脏长度、重量、大体形态改变及病理学评分。ELISA法检测结肠组织匀浆中肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)及白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达水平。[结果]1、运用DNA原核显微注射的方法成功构建KRT1转基因小鼠。采用经典育种与PCR相结合的方法鉴定出KRT1转基因小鼠。采用F3代KRT1转基因小鼠与非转基因小鼠交配,鉴定出阳性转基因小鼠作为KRT1杂合子序列转基因小鼠用于研究。2、运用4%DSS成功诱导出小鼠实验性结肠炎模型；3、TG DSS组小鼠较TG control组小鼠体重下降明显(5.7214±-0.66375 vs-0.6200±0.50775, P0.05)。WT DSS组小鼠体重下降较WT control组小鼠明显(4.7700±0.64611 vs-0.7464±0.99117,P0.05)。且模型组中TG DSS组小鼠体重下降较WT DSS组小鼠更为显著(5.7214±0.66375 vs4.7700±0.64611,P0.05)。4、TG DSS组小鼠DAI评分显著高于TG control组(3.9080±0.19713 vs0.0000±0.00000, P0.05), WT DSS组小鼠DAI评分亦显著高于WT control组(3.8222±0.24774 vs 0.0222±0.08607,P0.05)。且模型组中TG DSS组小鼠DAI评分升高较WT DSS组小鼠更为明显,但差异无统计学意义(3.9080±0.19713 vs3.8222±0.24774,P0.05)。对照组中转基因小鼠与野生型小鼠DAI评分无显著差异(P0.05)。5、TG DSS组小鼠结肠长度较TG control组小鼠明显缩短(4.2571±0.35673 vs7.3800±0.54668,P0.05),重量明显减轻(0.2193±0.03174 vs 0.3080±0.01146,P0.05)。野生型小鼠中WT DSS组小鼠结肠长度较WT control组小鼠明显缩短(4.5800±0.56467 vs 7.2333±0.56653,P0.05),重量明显减轻(0.2513±0.03623 vs0.2973±0.03305,P0.05)。模型组中TG DSS组小鼠结肠重量下降较WT DSS组更为显著(0.2193±0.03174 vs 0.2513±0.03623,P0.05),结肠长度亦较WT DSS组缩短,但差异无统计学意义(4.2571±0.35673 vs 4.5800±0.56467,P0.05)。对照组中TG control组与WT control组小鼠结肠长度及重量均无明显差异(P0.05)。6. TG DSS组小鼠脾脏重量较TG control组小鼠明显增加(0.1100±0.03162 vs0.0667±0.01113,P0.05)。WT DSS组小鼠脾脏重量较WT control组小鼠明显增加(0.0887±0.02532 vs 0.0573±0.01580,P0.05)。TG DSS组小鼠脾脏重量亦较WT DSS组小鼠增高,但差异无统计学意义(0.1100±0.03162 vs 0.0887±0.02532,P0.05)。7、模型组结肠可见充血、出血,与对照组相比结肠明显水肿、增厚。TG DSS组小鼠结肠炎症大体形态评分显著高于TG control组(2.7143±0.46881 vs0.0000±0.00000, P0.05)。WT DSS组小鼠结肠炎症大体形态评分也显著高于WT control组(2.5333±0.51640 vs 0.0000±0.00000,P0.05)。分别进行模型组及对照组组内比较,结果提示转基因小鼠与野生型小鼠结肠炎症大体形态评分无显著差异(P0.05)。HE染色观察可见模型组小鼠远端结肠上皮部分缺失、隐窝结构破坏,大量炎症细胞浸润至黏膜下层,TG DSS组小鼠病理学评分显著高于TG control组小鼠(11.8667±0.83381 vs 3.0000±0.37796,P0.05)。WT DSS组小鼠病理学评分亦显著高于WT control组(9.7333±1.79151 vs 0.0000±0.00000,P0.05)。且TG DSS组小鼠病理学评分较WT DSS组小鼠明显增高(11.8667±0.83381 vs 9.7333±1.79151, P0.05)。TG control组可见小鼠结肠黏膜层散在炎症细胞浸润,隐窝及结肠上皮结构正常。TG control组病理学评分明显高于WT control组(P0.05)。8、TG DSS组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β浓度均显著高于TG control组(84.7236±33.2125 vs 31.8401±3.8448, P0.05), (56.2919±22.2126 vs 16.0534±1.8604, P0.05)。WT DSS组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β浓度也较WT control组明显升高(63.5450±19.5156 vs 35.2294±4.8557,P0.05), (42.3633±13.0104 vs 17.5480±2.4053,P0.05)。且TG DSS组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β表达升高较WT DSS组小鼠更为明显(P0.05)。[结论]1、成功构建KRT1转基因小鼠,获得稳定的杂合子序列；2、4%DSS可成功建立小鼠实验性结肠炎模型；3、KRT1转基因小鼠对DSS诱导的实验性结肠炎具有更高的敏感性；4、KRT1基因编码序列,蛋白质的结构或功能异常可加重DSS诱导的肠道炎症,部分揭示KRT1在UC发病机制中的作用。
【关键词】：角蛋白1 转基因小鼠 DSS肠炎模型 溃疡性结肠炎 发病机制
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 缩略词表(以字母顺序排列)5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-17
• 材料与方法17-28
• 结果28-38
• 讨论38-42
• 结论42-43
• 参考文献43-51
• 附录51-61
• 综述61-73
• 参考文献68-73
• 攻读学位期间获得的学术成果73-74
• 致谢74

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本文编号：849615