MicroRNA-34a在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-14 11:14

  本文关键词：MicroRNA-34a在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

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【摘要】：背景与目的： 近年来随着人们生活水平的提高,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率逐年增加,成为常见的慢性肝病之一。而NAFLD发生发展机制目前尚未完全明确。近年来的研究发现,微小RNA (microRNA, miRNA)与肝脏疾病关系密切,我们前期发现miR-34a在两种NAFLD模型肝脏中表达均显著上调,提示miR-34a可能在NAFLD发生发展过程中起重要作用。发掘并分析miR-34a的作用靶标,对于揭示该miRNA的具体调节机制有着重要的作用。本研究以定量PCR (qPCR)的方法验证了miR-34a在NAFLD细胞和小鼠模型中的表达情况,并采用RNA干扰(RNAi)技术研究miR-34a在NAFLD中的生物学功能。同时,对所预测的miR-34a作用靶点PPARa进行验证。 方法： 1、采用游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)诱导L02细胞建立NAFLD细胞模型,用高脂饮食(high fat diet, HFD)喂养C57BL/6小鼠构建NAFLD动物模型,采用qPCR法测定miR-34a在L02细胞及C57BL/6小鼠肝脏中的表达变化； 2、通过体外转染niR-34a inhibitor或小鼠尾静脉注射miR-34a基因敲减慢病毒载体的方式来进行功能实验。以油红O染色、HE染色、生化分析探讨miR-34a表达抑制对脂变及炎症程度的影响； 3、结合在线数据库进行miR-34a靶基因的预测,并利用Western blot等进行靶蛋白表达量的验证,同时利用荧光素酶报告系统对miR-34a的作用靶序列进行鉴定。进一步运用Western blot、 qPCR等方法观察miR-34a表达变化后其靶标基因PPARa下游脂变相关基因的表达变化； 4、进一步运用PPARa siRNA探讨PPARa表达抑制对离体肝细胞脂变程度的影响,运用Western blot. qPCR等方法观察PPARa表达变化后其下游脂变相关基因的表达变化。 结果： 1、在NAFLD细胞和小鼠肝组织中miR-34a的表达水平显著上调； 2、通过对L02细胞转染miR-34a inhibitor或小鼠尾静脉注射miR-34a基因敲减慢病毒载体抑制miR-34a的表达,L02细胞胞浆及肝脏组织中脂滴沉积的程度得到显著改善,甘油三酯的含量明显下降,小鼠肝重/体重比值显著下降,小鼠血清中AST水平显著降低； 3、采用在线数据库预测发现PPARa是miR-34a可能的调控靶基因。我们在L02细胞及C57BL/6小鼠中检测到PPARa在miR-34a表达抑制后其基因及蛋白水平均有上调。进一步荧光素酶报告系统分析证实PPARa是miR-34a的直接作用靶点,其3’-UTR中存在miR-34a调控的作用序列. PPARa的下游脂变相关基因的表达随着PPARa的改变而改变。另外,通过抑制miR-34a的表达后,可以激活能量代谢通路上关键蛋白AMPK的表达； 4、通过对细胞转染PPARa siRNA抑制细胞中PPARa的表达,可以使细胞胞浆中脂滴沉积的程度明显加重,甘油三酯的含量也显著升高,PPARa的下游脂变相关基因的表达随着PPARa的改变而改变。 结论： miR-34a的表达与NAFLD密切相关,miR-34a的表达上调参与NAFLD的脂质代谢过程,miR-34a可能通过靶向PPARa成为NAFLD的潜在治疗靶点。
【关键词】：非酒精性脂肪性肝病 miR-34a PPARα 脂质代谢 AMPKⅣ
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 致谢5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 英文缩写词对照表12-16
• 1 引言16-22
• 1.1 miRNA简介16-17
• 1.2 miRNA的生物合成和功能17-18
• 1.3 miRNA在NAFLD中的意义18-20
• 1.4 miR-34a与NAFLD20-22
• 2 miR-34a在NAFLD模型中的表达情况22-38
• 2.1 前言22-23
• 2.2 材料与方法23-31
• 2.3 结果31-35
• 2.4 讨论35-37
• 2.5 结论37-38
• 3 miR-34a对L02胞和C57BL/6小鼠肝脏脂变及炎症的影响38-59
• 3.1 前言38-39
• 3.2 材料与方法39-49
• 3.3 结果49-56
• 3.4 讨论56-58
• 3.5 结论58-59
• 4 miR-34a的靶基因及影响NAFLD的分子机制探讨59-88
• 4.1 前言59-60
• 4.2 材料与方法60-73
• 4.3 结果73-84
• 4.4 讨论84-86
• 4.5 结论86-88
• 5 总结与展望88-89
• 6 参考文献89-95
• 综述95-112
• 摘要95
• abstract95-106
• 5 参考文献106-112
• 作者简历及在学期间参与课题和发表论文11

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;非酒精性脂肪性肝病诊疗指南[J];中华肝脏病杂志;2006年03期

2 Serkan Dogan;Gokmen Zararsiz;Sebnem Gursoy;Kadri Guven;Omer Ozbakir;Munis Dundar;Mehmet Yucesoy;;Circulating microRNAs in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Hepatology;2014年08期

3 Glenn S Gerhard;Johanna K DiStefano;;Micro RNAs in the development of non-alcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Hepatology;2015年02期

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本文编号：849689