TLR4介导的信号通路对肝细胞凋亡的影响及氧化苦参碱的干预机制研究

发布时间：2017-09-22 08:47

  本文关键词：TLR4介导的信号通路对肝细胞凋亡的影响及氧化苦参碱的干预机制研究

  更多相关文章： BRL-3A细胞 大鼠急性肝衰竭 TLR4/PI3K/AKT/GSK3β TLR4/P38/JNK 细胞凋亡 氧化苦参碱

【摘要】：第一部分TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信号通路对大鼠肝BRL-3A细胞凋亡的影响目的探讨大鼠肝BRL-3A细胞中是否有Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)介导的PI3K/AKT/GSK3β信号通路,及该通路在BRL-3A细胞凋亡中的作用与机制,为急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的预防和治疗提供新的靶点。方法采用大鼠肝BRL-3A细胞,运用脂多糖(lipopolsaccharide,LPS)建立肝细胞凋亡模型。分别应用TLR4抑制剂(CLI-095)、PI3K/AKT抑制剂(LY294002)和GSK3β抑制剂(LiCl)预处理BRL-3A细胞,以减弱或加强TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信号转导通路的作用。CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率;Hoechst 33342染色法观察LPS刺激及TLR4抑制剂阻断后细胞凋亡的形态;Western-blot法检测BRL-3A细胞内AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、Bax、Bcl-2及active-caspase-3蛋白的表达;实时定量PCR法(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测BRL-3A细胞内Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA的表达;免疫荧光法观察GSK3β核易位情况。结果(1)CCK-8法结果显示,LPS(10μg/ml)刺激BRL-3A细胞不同时间(1、3、6、12、24 h)后,细胞活力均明显低于对照组(P0.05),LPS作用于BRL-3A细胞24 h后其活力为对照组的58%(P0.05)。(2)Hoechst 33342染色法结果显示,LPS刺激后,随着刺激时间的延长,BRL-3A细胞凋亡增多,并出现坏死细胞,刺激24 h可见细胞核碎片和核固缩。TLR4抑制剂(CLI-095)预处理组凋亡细胞明显减少,未见凋亡小体。(3)流式细胞术结果显示,LPS(10μg/ml)刺激BRL-3A细胞不同时间(1、3、6、12、24h)后,细胞凋亡率逐渐上升(p0.01),24hbrl-3a细胞凋亡率达68.30%。与lps组比较,cli-095+lps组可以减少lps刺激引起的brl-3a细胞凋亡率(p0.05);ly294002+lps组细胞凋亡率增加(p0.05);licl+lps组细胞凋亡率下降(p0.05)。(4)western-blot法结果显示,正常对照组brl-3a细胞中有akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9的表达;lps组p-aktser473和p-gsk3βser9的表达低于正常对照组(p0.05);与lps组比较,cli-095+lps组p-aktser473和p-gsk3βser9的表达有所上调;而ly294002+lps组的p-aktser473和p-gsk3βser9表达下调(p0.05);licl+lps组p-gsk3βser9的表达上调(p0.05)。(5)免疫荧光法检测gsk3β核易位结果显示,正常对照组中gsk3β主要表达在brl-3a细胞质中;lps组gsk3β大多易位到胞核;与lps组比较,cli-095、licl预处理组gsk3β核易位均不同程度减弱,ly294002预处理组gsk3β核易位作用增强。(6)rt-qpcr法检测结果显示,与正常对照组比较,lps组bax/bcl-2及caspase-3mrna的表达均上调(p0.05);与lps组比较,cli-095+lps组及licl+lps组bax/bcl-2及caspase-3mrna表达降低(p0.05);ly294002+lps组bax/bcl-2及caspase-3mrna表达上调(p0.05)。(7)western-blot法测定结果显示,与正常对照组比较,lps组bax/bcl-2及active-caspase-3表达均上调(p0.05)。与lps组比较,cli-095+lps组及licl+lps组bax/bcl-2及active-caspase-3表达降低(p0.05);ly294002+lps组bax/bcl-2及active-caspase-3表达上调(p0.05)。结论(1)brl-3a细胞中有tlr4介导的pi3k/akt/gsk3β信号通路。(2)brl-3a细胞tlr4激活后,p-aktser473和p-gsk3βser9表达下调,使bax/bcl-2及active-caspase-3的表达增加,细胞凋亡率升高。brl-3a细胞凋亡过程中有tlr4介导的pi3k/akt/gsk3β信号通路的参与。第二部分tlr4/p38/jnk信号通路对大鼠肝brl-3a细胞凋亡的影响目的探讨大鼠肝brl-3a细胞中是否有tlr4介导的p38/jnk信号通路,及该通路在brl-3a细胞凋亡中的作用与机制,为急性肝衰竭的预防和治疗提供新的靶点。方法采用大鼠肝brl-3a细胞,应用lps建立肝细胞凋亡模型。分别运用tlr4抑制剂(cli-095)、p38抑制剂(sb203580)、jnk抑制剂(sp600125)及erk抑制剂(fr180204)预处理brl-3a细胞,以影响tlr4/p38/jnk信号转导通路的作用。流式细胞术检测细胞凋亡率;western-blot法检测brl-3a细胞内jnk、p-jnk、p38、p-p38、bax、bcl-2及active-caspase-3蛋白的表达;rt-qpcr检测大鼠肝细胞bax、bcl-2及caspase-3mrna的表达。结果(1)流式细胞术结果显示,lps组细胞凋亡率高于正常对照组(p0.05);而cli-095+lps组、sb203580+lps组、sp600125+lps组细胞凋亡率显著低于lps组(p0.05);fr180204+lps与lps组比较无明显差异。(2)western-blot结果显示,lps组p-p38,p-jnk表达明显高于正常对照组(p0.05);cli-095+lps组、sb203580+lps组、sp600125+lps组p-p38,p-jnk表达显著低于lps组(p0.05);fr180204+lps组与lps组比较无明显差异。(3)rt-qpcr结果显示,lps组bax/bcl-2及caspase-3mrna明显高于正常对照组(p0.05);cli-095+lps组、sb203580+lps组和sp60012+lps组bax/bcl-2及caspase-3mrna表达均显著低于lps组(p0.05);fr180204+lps组bax/bcl-2及caspase-3mrna表达无明显变化。(4)western-blot结果显示,lps组bax/bcl-2及active-caspase-3表达比正常对照组高(p0.05);cli-095+lps组、sb203580+lps组和sp60012+lps组bax/bcl-2及active-caspase-3表达显著低于lps组(p0.05);fr180204+lps组与lps组比较无明显差异。结论(1)brl-3a细胞中有tlr4介导的p38/jnk信号通路。(2)brl-3a细胞tlr4激活后,p-p38、p-jnk表达增加,使bax/bcl-2的比例和active-caspase-3表达增加,从而促进brl-3a细胞的凋亡。brl-3a细胞凋亡过程中有tlr4介导的p38/jnk信号通路的参与。第三部分氧化苦参碱对大鼠肝brl-3a细胞凋亡的抑制作用及其机制研究目的探讨氧化苦参碱(oxymatrine,omt)对lps诱导的大鼠肝brl-3a细胞凋亡的抑制作用及其机制,为omt抑制肝细胞凋亡提供更多的实验依据。方法采用lps诱导大鼠肝brl-3a细胞建立细胞凋亡模型。应用cck-8法测定omt对brl-3a细胞活力的影响;生物化学法测定不同剂量omt对lps诱导的brl-3a细胞乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)释放率的影响。根据ldh释放率选择omt浓度为0.75、1.5、3.0g/l进行后续实验。然后实验分5组:正常对照组,lps组,omt低剂量+lps组,omt中剂量+lps组,omt高剂量+lps组。hochest33342染色观察细胞凋亡形态;流式细胞仪检测细胞凋亡率;rt-qpcr法检测brl-3a细胞中bax、bcl-2、caspase-3mrna的表达;western-blot法检测brl-3a细胞中akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9、p38、p-p38、jnk、p-jnk、bax、bcl-2和active-caspase-3蛋白的表达;免疫荧光观察gsk3β核易位情况。结果(1)不同剂量的(0.375~6.0g/l)omt和brl-3a细胞共培养24h,brl-3a细胞生长状态良好。(2)lps刺激brl-3a细胞后,ldh释放率增加(p0.01),而omt预处理后能明显降低ldh的释放率(p0.05或p0.01)。(3)cck-8法结果显示,lps组细胞活力明显降低(p0.05),omt预处理可以明显减弱由lps引起的细胞活力降低(p0.05或p0.01)。(4)流式细胞术结果显示:lps组brl-3a细胞凋亡率明显高于正常对照组(p0.05),omt预处理可以显著降低由lps刺激引起brl-3a细胞凋亡率的增加(p0.05)。(5)hochest33342染色结果显示,lps组可见brl-3a细胞凋亡增多,omt预处理后凋亡细胞明显减少。(6)western-blot检测结果显示,lps组tlr4表达增加(p0.05),p-aktser473和p-gsk3βser9表达降低(p0.05),p-p38、p-jnk表达增加(p0.05);与lps组比较,omt中、高剂量预处理可以下调tlr4的表达,并上调p-aktser473和p-gsk3βser9的表达(p0.05),下调p-p38、p-jnk的表达(p0.05或p0.01)。(7)免疫荧光结果显示,omt预处理能明显减少lps刺激引起的gsk3β核易位。(8)rt-qpcr结果显示,lps组bax/bcl-2及caspase-3mrna表达明显增高(p0.05)。与lps组比较,omt预处理能明显降低由lps诱导的brl-3a细胞中bax/bcl-2及caspase-3mrna表达上调(p0.05或p0.01)。(9)western-blot结果显示,omt预处理能明显降低由lps诱导的brl-3a细胞中bax/bcl-2及active-caspase-3表达上调(p0.05)。结论(1)omt预处理可以显著降低由lps诱导的brl-3a细胞凋亡。(2)omt能上调经lps刺激的brl-3a细胞p-aktser473和p-gsk3βser9水平,减少lps刺激引起的gsk3β核易位,降低经lps激活的p38和jnk磷酸化水平,下调bax/bcl-2的比例和active-caspase-3的表达,从而明显抑制brl-3a细胞凋亡。(3)omt通过tlr4/pi3k/akt/gsk3β及tlr4/p38/jnk信号通路抑制brl-3a细胞凋亡。第四部分氧化苦参碱对急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡的抑制作用及其机制研究目的探讨氧化苦参碱(omt)对lps/d-galn诱导的急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡的抑制作用及其机制,为临床防治急性肝衰竭抑制肝细胞凋亡寻找有效的药物。方法采用lps/d-galn建立大鼠急性肝衰竭模型。100只大鼠随机分为5组:正常对照组,模型组,omt低、中、高剂量组。应用he染色光镜观察肝脏病理学改变;透射电镜观察细胞凋亡情况;全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平;elisa法测定各组大鼠外周血肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor,tnf-α)和白介素-1β(interleukin-1β,il-1β)水平;流式细胞术测定各组大鼠肝细胞凋亡率;western-blot检测肝组织中akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9、p38、p-p38、jnk、p-jnk、bax、bcl-2和active-caspase-3的表达。免疫组化s-p法观察肝组织tlr4、bax、bcl-2和active-caspase-3的表达;结果(1)各组大鼠死亡率及肝脏大体情况,正常对照组和omt低、中、高剂量组无大鼠死亡;模型组大鼠死亡率达30%。模型组可见肝脏大体肿胀明显,表面弥漫出血,大片瘀斑,呈暗红色,omt低、中、高剂量组肝脏大体不同程度的好转。(2)he染色见模型组肝细胞明显坏死,大片状坏死和出血,仅少量肝细胞残存,散在分布,无正常肝小叶结构,纤维网状支架塌陷,汇管区大量炎症细胞浸润。透射电镜显示模型组肝细胞坏死明显,形态不规则,可见核皱缩和核碎裂,见凋亡小体,肝细胞内线粒体严重损害,无明显细胞器结构。omt各剂量预处理可不同程度改善肝组织病理损伤。(3)生化分析仪测定结果显示,模型组大鼠外周血ast、alt的水平明显高于正常对照组(p0.05),omt各剂量组,ast、alt的水平显著低于模型组(p0.05)。(4)elisa法结果显示,模型组大鼠外周血tnf-α和il-1β水平明显高于正常对照组(P0.01),OMT各剂量组,TNF-α和IL-1β水平显著低于模型组(P0.05或P0.01)。(5)流式细胞术结果显示,模型组肝细胞凋亡率明显增加(P0.05),与模型组比较,OMT中、高剂量预处理可以降低肝细胞凋亡率(P0.05)。(6)Western-blot法结果显示,模型组TLR4表达增加(P0.05),P-AKTSer473和P-GSK3βSer9表达降低(P0.05),P-P38、P-JNK表达增加(P0.05);与模型组比较,OMT中、高剂量预处理可以下调TLR4的表达(P0.05),并上调P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表达(P0.05),下调P-P38、P-JNK的表达(P0.05)。(7)Western-blot法检测Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白结果显示,模型组Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表达明显高于正常对照组(P0.05)。与模型组比较,OMT预处理可下调Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表达(P0.05)。(8)免疫组化法结果显示,模型组TLR4、Bax、active-caspase-3表达明显增高,Bcl-2的表达较正常对照组有所下降(P0.05)。与模型组比较,OMT预处理可下调TLR4、active-caspase-3及Bax的表达,上调Bcl-2的表达(P0.05)。结论(1)OMT预处理能改善LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭大鼠肝组织病理损伤,明显降低血清转氨酶,保护肝细胞。(2)OMT能降低急性肝衰竭大鼠肝组织TLR4的表达、上调P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表达,下调GSK3β表达;下调P-P38、P-JNK的表达,使TNF-α和IL-1β水平降低,下调Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表达,从而明显抑制肝细胞凋亡。(3)OMT通过TLR4/PI3K/AKT/GSK3β及TLR4/P38/JNK信号通路抑制急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡。
【关键词】：BRL-3A细胞 大鼠急性肝衰竭 TLR4/PI3K/AKT/GSK3β TLR4/P38/JNK 细胞凋亡 氧化苦参碱
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.3
【目录】：

• 中文摘要4-11
• Abstract11-21
• 引言21-23
• 第一部分 TLR4/PI3K/AKT/GSK3Β 信号通路对大鼠肝BRL-3A细胞凋亡的影响23-55
• 1.1 前言23
• 1.2 材料23-27
• 1.3 方法27-38
• 1.4 结果38-48
• 1.5 讨论48-54
• 1.6 小结54-55
• 第二部分 TLR4/P38/JNK信号通路对大鼠肝BRL-3A细胞凋亡的影响55-67
• 2.1 前言55
• 2.2 材料55-56
• 2.3 方法56-57
• 2.4 结果57-62
• 2.5 讨论62-66
• 2.6 小结66-67
• 第三部分 氧化苦参碱对BRL-3A细胞凋亡的抑制作用及其机制研究67-86
• 3.1 前言67-68
• 3.2 材料68
• 3.3 方法68-71
• 3.4 结果71-80
• 3.5 讨论80-85
• 3.6 小结85-86
• 第四部分 氧化苦参碱对急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡抑制作用及其机制研究86-130
• 4.1 前言86
• 4.2 材料86-87
• 4.3 方法87-92
• 4.4 结果92-121
• 4.5 讨论121-128
• 4.6 小结128-130
• 参考文献130-145
• 综述 肝细胞凋亡信号途径研究进展145-180
• 参考文献166-180
• 英文缩略词表180-182
• 攻读学位期间取得的科研成果182-183
• 致谢183-184

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本文编号：899892