炎性Treg细胞在小鼠胆道闭锁胆管炎症中的作用及机制的研究

发布时间：2017-09-24 11:01

  本文关键词：炎性Treg细胞在小鼠胆道闭锁胆管炎症中的作用及机制的研究

  更多相关文章： 小鼠BA模型 Treg细胞 IL-17+Foxp3+Treg细胞 表观遗传学

【摘要】：研究背景和目的： 自身免疫反应所致胆管进行性炎性损伤是胆道闭锁(BA)重要发病机制。前期研究发现BA患儿汇管区有大量Foxp3+Treg浸润,其具有异质性,包含有致炎效应的IL-17+Foxp3+Treg亚群。文献报道,表观遗传学修饰是调控Foxp3表达的重要机制。我们推测BA汇管区细胞因子(TGF-β、IL-6等)消长可通过表观遗传学机制调控T细胞FoxP3基因表达,诱导IL-17+FoxP3+Treg分化并分泌IL-17A,从而介导胆管损伤。鉴此,本项目拟开展如下研究：①动态观察BA小鼠模型肝脏微环境细胞因子(TGF-β、IL-6等)表达特点、Treg细胞Foxp3基因启动子DNA甲基化状态,以及对Foxp3基因表达、Treg细胞亚群分化的影响；②用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deo-xycytidine, Aza)修饰Foxp3基因,观察肝脏炎症环境中不同Treg细胞亚群功能状态及其与胆管损伤相关性。明确BA小鼠模型中IL-17+Foxp3+Treg形成以及参与胆管损伤机制。 研究方法： 第一部分：SPF级Balb/c小鼠随机分为正常对照组和BA组,BA组小鼠出生后12小时内腹腔注射恒河猴轮状病毒(RRV)建立胆道闭锁模型。于出生小鼠第4天、第7天、第10天处死(BA组和对照组)并摘取肝脏。动态检测小鼠肝脏组织中炎性细胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性细胞因子(IL-10、TGF-β的变化；IL-17+FoxP3+Treg细胞、IL-17-Foxp3+Treg细胞的分布特点、细胞绝对数和占CD4+T细胞的比例；以及Foxp3基因启动子CpG岛甲基化变化水平。 第二部分：SPF级Balb/c小鼠随机分为正常对照组、BA组和Aza干预组,BA组小鼠出生后12小时内腹腔注射恒河猴轮状病毒(RRV)建立胆道闭锁模型,Aza干预组在新生鼠RRV建模后连续4天腹腔注射甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, Aza),分别观察三组小鼠出生第4天、第7天、第10天观察肝脏组织中炎性细胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性细胞因子(IL-10、 TGF-β)的变化,Foxp3基因启动子CpG岛甲基化水平,IL-17+FoxP3+Treg细胞、IL-17-Foxp3+Treg细胞和Th17细胞的比例,以及对胆管炎症损伤和小鼠生存率的影响。 实验结果： 第一部分：BA组所检测各细胞因子在第4天表达量逐渐上升,在第7天达到峰值,与对照组相比,IL-6表达量升高31倍、IL-10提高了6倍、INF-γ提高了11倍,TGF-β提高了3.2倍,差异具有统计学意义(P0.05)；IL-17、IL-23第4天含量逐渐上升,第10天达到峰值,与对照组相比,IL-17为6倍,IL-23为4倍,差异具有统计学意义(P值分别为P0.001,P0.01,P0.05,P0.05)。流式细胞仪检测BA组小鼠肝脏淋巴细胞中IL-17-Foxp3+Treg、IL-17+Foxp3+Treg/CD4+细胞比例及绝对数,从第4天开始升高,第7天达到峰值,随后逐渐下降,各时间点均较对照组升高(P值均小于0.05)；免疫荧光组织化学显示第7天BA组小鼠肝脏汇管区存在大量IL-17-Foxp3+Treg、 IL-17+Foxp3+Treg细胞(P0.05)。流式细胞仪检测BA组小鼠肝脏淋巴细胞中IL-17+ToxP3+Treg/CD4+细胞比例从第4天开始升高,第7天达到峰值,随后逐渐下降,各时间点均较正常对照组明显升高(P0.05)；从细胞绝对值来看,第7天、第10天BA小鼠IL-17+Foxp3+Treg细胞、IL-17-Foxp3+Treg细胞数量明显高于正常对照组(P0.05)。亚硫酸氢盐测序法(BSP)显示BA组第4天、第7天、第10天肝脏组织中FoxP3+Treg细胞中Foxp3基因启动子CpG岛甲基化程度逐渐增高(第10天略有下降)且均高于正常对照组(P0.05)。 第二部分：Aza干预组小鼠肝脏中细胞因子IL-6、INF-γ、IL-17、IL-23在第4天、第7天、第10天较BA组小鼠中的表达下降明显,且具有统计学意义(P0.05)；Aza组细胞因子IL-10和TGF-β含量在第7天较BA组升高(P0.05),并持续升高第10天。流式细胞术检测显示,第7天Aza干预组IL-17+FoxP3+Treg细胞比例和Th17占CD4+比例较BA组开始出现下降(P0.05)；第7天、第10天Aza组IL-17+FoxP3+Treg细胞、Th17细胞的绝对数值低于BA组(P值均小于0.05)。BSP显示Aza干预组第4天、第7天、第10天Foxp3+Treg细胞中Foxp3基因启动子CpG岛甲基化均低于对照组(P0.05)。HE组织病理学染色显示,第4天、第7天、第10天Aza干预组肝脏汇管区组织炎性病理损伤较BA组均减轻。Aza干预组小鼠的生存率较BA组回升(P0.05)。 实验结论： 1、RRV诱导的小鼠胆道闭锁模型中,肝内胆管微环境中炎性细胞因子和IL-17+Foxp3+Treg细胞发生着先升高后逐渐下降的变化。其中INF-γ、IL-6、IL-10、TGF-β细胞因子早于IL-17、IL-23细胞因子达到峰值。而Foxp3基因持续保持高DNA甲基化水平。 2、微环境中IL-6可上调Foxp3基因启动子DNA甲基化,IL-6和TGF-β共同作用可能是促进IL-17+FoxP3+Treg细胞分化形成炎性Treg细胞并参与BA胆管损伤的重要原因。 3、DNA甲基化抑制剂(Aza)可下调Foxp3基因甲基化水平,减少IL-17+Foxp3+Treg细胞产生,抑制炎性因子(IL-17A)的产生,从而减轻BA胆管损伤。
【关键词】：小鼠BA模型 Treg细胞 IL-17+Foxp3+Treg细胞 表观遗传学
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.7
【目录】：

• 前言9-16
• 参考文献12-16
• 摘要16-19
• Abstract19-23
• 英文缩略词表23-26
• 第一部分 炎性T细胞在胆道闭锁小鼠中的表达及机制研究26-62
• 材料29-36
• 一、RRV病毒培养和病毒滴度测定29
• 二、Balb/c小鼠建立胆道闭锁模型29-30
• 三、实验试剂30-32
• 四、试剂盒32
• 五、抗体32-33
• 六、实验材料33-34
• 七、仪器设备34-35
• 八、细胞和病毒35-36
• 方法36-45
• 一、小鼠肝脏中炎性调节性T细胞的表达及分布36-37
• 二、肝脏内细胞因子的检测37-38
• 三、小鼠肝脏中调节性T细胞的分离和检测方法38
• 四、流式细胞术检测IL-17Foxp3~+Treg细胞38-39
• 五、小鼠肝脏内炎性Foxp3基因的表观遗传学的检测39-44
• 六、统计学处理44-45
• 结果45-57
• 一、胆道闭锁发生率及症状表现45-48
• 二、肝脏内细胞因子的检测48-50
• 三、调节性T细胞亚群在小鼠肝脏中分布50-51
• 四、调节性T细胞亚群在小鼠肝脏CD4+细胞中的比例51-53
• 五、IL-17~+Foxp3~+细胞和IL-17~-Foxp3~+细胞中CD25的表达53
• 六、IL-17~+Foxp3~+细胞和IL-17~-Foxp3~+细胞CD4~+T细胞中的比例53-55
• 七、小鼠肝脏内Foxp3~+Treg细胞甲基化的检测55-57
• 讨论57-60
• 参考文献60-62
• 第二部分 Foxp3基因甲基化调控在小鼠胆道闭锁肝脏炎性调节性T细胞及调节性T细胞的作用影响62-102
• 材料65-72
• 一、Balb/c小鼠建立胆道闭锁模型65
• 二、实验试剂65-67
• 三、试剂盒67-68
• 四、抗体68
• 五、实验材料68-69
• 六、仪器设备69-71
• 七、细胞和病毒71-72
• 方法72-84
• 一、小鼠肝脏中炎性调节性T细胞的表达及分布72-73
• 二、Aza干预后小鼠肝脏内细胞因子的检测73-74
• 三、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Foxp3、ROR-γ t和IL-17mRNA及其相关蛋白的表达74-78
• 四、Aza干预后小鼠肝脏中炎性调节性T细胞的分离和检测78
• 五、Aza干预后小鼠肝脏内炎性T细胞表观遗传学的检测78-83
• 六、统计学处理83-84
• 结果84-96
• 一、Aza干预后炎性调节性T细胞亚群在小鼠肝脏CD4~+细胞中的比例84-87
• 二、Aza干预后调节性T细胞亚群在小鼠肝脏中的分布87-89
• 三、Aza干预后肝脏内细胞因子的检测89-90
• 四、Aza干预后检测胆道闭锁小鼠Foxp3,IL-17A以及ROR-γ t基因和蛋白表达的变化90-92
• 五、Aza干预后炎性调节性T细胞亚群在小鼠肝脏CD4~+细胞中的比例92-93
• 六、Aza干预后小鼠肝脏内Foxp3~+Treg细胞甲基化的检测93-96
• 讨论96-99
• 参考文献99-102
• 结论102-103
• 综述103-116
• 参考文献111-116
• 致谢116-118
• 附录 在校攻读学位期间发表论文118

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