炎症模型在结肠炎治疗药药效学评价及何首乌毒性评价中的应用

发布时间：2017-09-24 17:14

  本文关键词：炎症模型在结肠炎治疗药药效学评价及何首乌毒性评价中的应用

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【摘要】：目的和意义:消化系统疾病常伴有发病急,不易治愈的特点。炎症反应参与了消化系统疾病的发生与发展过程。炎症动物模型在消化系统疾病治疗药的药效评价、毒性评价中至关重要。炎症动物模型包括用于药效评价的常规动物模型及毒性评价的特异质毒性动物模型。其中,炎症动物模型是用于补充正常动物模型无法模拟特异质毒性的不足,能更好的模拟临床。因此,我们将从消化系统疾病中与免疫相关的两类疾病入手,即以炎症性肠病及药物性肝损伤为研究对象,建立与临床更为接近的实验用炎症动物模型,以期对IBD有效治疗药物进行药效学,并对何首乌肝损伤进行毒性评价、探究其可能机制及潜在生物标志物。首先,炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD),包括克罗恩病和溃疡性结肠炎,是由免疫紊乱引起的慢性炎症性疾病,具有不易治愈且反复发作的特点。伴随腹痛、腹泻、血便等特征,病程可长达20年之久,患者饱受生理和心理上双重折磨,严重影响生存质量。IBD发病机制并不完全明确。然而临床常用药疗效欠佳,副作用大,急需筛选可靠的IBD治疗药。严重或长期生理及心理性刺激可引起机体神经、内分泌和免疫系统紊乱引起炎症反应。免疫调节药物、营养支持和神经内分泌调节药物等措施可有效防止应激反应诱导的免疫功能紊乱。此外,精神抑郁和焦虑对IBD的发生和复发有一定的影响,精神因素可以是IBD发作的诱因,亦可以是IBD反复发作的继发性表现。因此,本论文第一部分旨在建立大鼠急性炎症性肠病模型,并针对神经、内分泌和免疫系统间相互调控,选取了以抗氧化应激功能为主的维生素E和潜在抗抑郁治疗药-新型CRFR1受体拮抗剂P16,对IBD动物模型进行药效学评价,以期为临床治疗IBD提供合理数据支持。另一方面,药物性肝损伤已成为药品因安全性问题撤市的最常见原因之一。在我国,中草药所致的肝损伤已经超过抗结核药,成为药物性肝损伤最主要诱因。其特征表现为病死率高、危害大,难以早期发现。近年来国内外关于何首乌引起肝损伤的临床报道屡见不鲜,即便从保护传统医学的角度,CFDA也已从2013年10月首次发布关于修订含何首乌口服制剂的说明书的通知,发展至2014年7月明确的提示关注口服何首乌药肝风险。何首乌致药物性肝损伤机制并未明确,且化学成分复杂,无疑加大了研究难度。在我国与临床何首乌致人肝损伤相比,传统何首乌致动物肝损伤模型造模给药剂量为临床拟用剂量200倍且时间长,多为1-3个月,并不能真实模拟临床情况,因此,本研究第二部分旨在建立与临床特征更为接近的何首乌致大鼠肝损伤动物模型,研究何首乌醇提液对大鼠的急性毒性,以期为临床合理用药及监测提供试验依据,探讨TLR4与何首乌致肝损伤相关性并应用i TRAQ技术进行模型动物肝脏差异表达蛋白筛选,探究何首乌致肝损伤可能机制。观察潜在药物性肝损伤血清生物标志物micro RNA-122在该模型中表达变化,为筛选潜在诊断生物标志物提供可能。材料与方法:1.IBD炎症动物模型的建立及治疗药的药效学评价。(1)葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导大鼠急性IBD模型的建立及维生素E治疗IBD药效学评价。将雄性Wistar大鼠分为如下6组,空白对照组(Ctrl),DSS组(DSS),泼尼松龙组(P),维生素E低剂量组(EL),维生素E中剂量组(EM),维生素E高剂量组(EH)。除空白对照组外,各组均给予5%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)连续自由饮用7天,用以建立急性IBD动物模型。第8天,Ctrl组及DSS组半数动物麻醉后采血并活检。以体重、脏器系数、临床观察评分及组织病理检查等指标判定模型是否建立成功。模型成功建立后,以泼尼松龙为阳性治疗对照药,并给予低、中、高三个剂量的维生素E连续7天对炎症动物模型进行药效学评价。第15天,剩余动物全部麻醉后采血并活检,依照体重、脏器系数、临床观察评分及组织病理检查等指标判定治疗效果。其中,建模成功后,及治疗结束时应用Elisa检测结肠中促炎细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量,用以判定维生素E抑制IBD可能机制。(2)同样的研究方法用于研究P16干预及治疗IBD药效学评价。将雄性Wistar大鼠分为如下9组,空白对照组(Ctrl),DSS组(DSS),泼尼松龙组(P),P16干预低剂量组(pre-P16L),P16干预中剂量组(pre-P16M),P16干预高剂量组(pre-P16H),P16治疗低剂量组(P16L),P16治疗中剂量组(P16M)和P16治疗高剂量组(P16H)。除空白对照组外,各组均给予5%DSS连续自由饮用7天,用以建立急性IBD动物模型。在建立IBD动物模型过程中,同时连续7天给予低、中、高三个剂量P16进行干预给药。第8天,Ctrl组及DSS组半数动物麻醉后采血并活检。以体重、脏器系数、临床观察评分及组织病理检查等指标判定模型是否建立成功。模型成功建立后,以泼尼松龙为阳性治疗对照药,并连续7天分别给予P16L、P16M、P16H组低、中、高三个剂量的P16,各P16干预组停止给予DSS及不同剂量P16,对炎症动物模型进行干预及治疗药效学评价。第15天,剩余动物全部麻醉后采血并活检,依照体重、脏器系数、临床观察评分及组织病理检查等指标判定治疗效果。其中,建模成功后,及治疗结束时应用Elisa检测结肠中促炎细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量,用以判定判定P16干预及治疗IBD可能机制。2.何首乌致肝损伤炎症动物模型的建立,其可能机制探究及潜在生物标志物micro RNA-122的验证。(1)预筛选何首乌致特异质肝损伤炎症动物模型激活剂。分别连续4天3.5%DSS动物自由饮用及单次给予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)以期激活SD大鼠枯否细胞,然后给予大鼠何首乌醇提液连续7天,麻醉后采血并活检,用以筛选更有效模型激活剂。(2)LPS激活后给予动物何首乌醇提液进行急性毒性实验,按照改良寇氏法测定何首乌醇提液对SD大鼠口服半数致死量(LD50)、最大耐受量(MTD)和最大给药量(MLD)。正式试验设计5个剂量组,分别为30g/kg、39g/kg、51g/kg、69g/kg、90g/kg(r=1.32)及空白对照组,60只大鼠随机分6组,每组10只,雌雄各半。尾静脉注射给予各组大鼠4mg/kg LPS 2小时后,单次灌胃给予何首乌体积剂量依次分别为10ml/kg、13ml/kg、17ml/kg、23ml/kg、30ml/kg,连续观察14天,观察其急性毒性症状谱,记录累积死亡数及大鼠体重变化。(3)经LPS激活后建立何首乌致肝损伤动物模型。将雄性SD大鼠按如下分为8组:空白对照组(Ctrl),LPS组(DSS),对乙酰氨基酚组(APAP),LPS+对乙酰氨基酚组(LPS+APAP),何首乌低剂量组(PMT-L),何首乌高剂量组(PMT-H),LPS+何首乌低剂量组(LPS+PMT-L),LPS+何首乌高剂量组(LPS+PMT-H)。按动物体重,尾静脉注射给予LPS组、LPS+APAP组、LPS+PMT-L组和LPS+PMTH组4mg/kg LPS。2小时后,按组别分别灌胃给予对APAP组、LPS+APAP组大鼠312mg/kg对乙酰氨基酚,PMT-L组及LPS+PMT-L组3g/kg(相当于临床给药剂量的15倍)何首乌,PMT-H组、及LPS+PMT-H大鼠6g/kg(相当于临床给药剂量的30倍)何首乌,每日一次,连续给药7天建立特异质肝损伤炎症模型。在建模过程中,取第2小时、14小时、5天、8天四个不同时间点,分别对各组别动物麻醉后采血及取肝脏待测。以组织病理学检查和血液生化检查等指标判定模型是否建立成功。(4)对模型动物肝脏组织中m TLR4表达水平进行测定,判定模型建立成功可能机制与TLR4相关性。(5)同时,检测血清micro RNA-122表达水平,按组别计算出各组各时间点相对值。并与四个时间点,各组血清ALT、ALP变化相对值及肝脏m TLR4表达相对值进行比较。判定其作为潜在何首乌致肝损伤的可能性,对其稳定性及灵敏性进行比较。(6)应用i TRAQ技术对肝脏样本中高丰度差异表达蛋白进行筛选,以期探究该模型相关机制及通路。结果:1.IBD炎症动物模型的建立及治疗药的药效学评价。(1)与空白对照组相比,连续给予大鼠5%DSS自由饮用7天后,DSS组大鼠出现明显的溏便及血便,临床观察评分显著升高(p0.05),且胸腺皮质、脾脏白髓及肠系膜淋巴结发生不同程度萎缩,肝脏、脾脏、结肠可见明显的膨大肿胀,淋巴细胞坏死;病理组织切片可见,结肠部位明显溃疡,并伴有黏膜脱落;结肠及肠系膜淋巴结中促炎因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量显著升高,说明免疫细胞异常活化,DSS诱导的大鼠急性IBD模型成功建立。模型成功建立后,DSS模型对照组自行恢复7天效果不明显,各给药组结肠中IL-12、IL-18、TNF-α显著降低,且表现出不同程度的治疗作用。三个剂量维生素E组溏便及便血得到缓解,结肠溃疡不同程度恢复。提示维生素E可治疗DSS诱导大鼠急性结肠炎,治疗效果与给药剂量呈正相关。(2)第15天,干预及治疗给予P16可有效抑制DSS诱导结肠炎大鼠体重减轻症状,临床观察评分可见大鼠稀便等现象显著缓解。剩余大鼠麻醉后活检可见,大鼠结肠炎症得到缓解。与DSS组大鼠结肠相比,P16三个干预组结肠仅出现轻微粘膜溃疡。P16不同剂量组能不同程度的干预或减轻DSS诱导大鼠结肠炎症的发生。P16高剂量干预组能有效地改善结肠炎。结肠组织病理学检查表明,泼尼松龙和P16促进DSS诱导结肠炎的恢复。与DSS组大鼠相比,泼尼松龙组和P16三个治疗组大鼠结肠的深层损伤和炎症的严重程度减轻,高剂量P16组大鼠结肠炎恢复效果更好。与DSS组相比,泼尼松龙组、P16三个干预组和P16三个治疗组促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、TNF-α和IFN-γ表达显著降低。另一方面,肝脏组织病理学观察,DSS组、P16三个干预组和P16三个治疗组未见明显的肝毒性。2.何首乌致肝损伤炎症动物模型的建立,其可能机制探究及潜在生物标志物micro RNA-122的验证。(1)前期模型筛选,我们分别用3.5%DSS与4mg/kg LPS作为激活剂,与DSS组相比,给予SD大鼠20倍临床剂量何首乌后7天,可见LPS组动物全部出现溏便,眼睑分泌异常,脏器系数增加显著,ALT显著升高,组织病理学观察可见枯否细胞激活,伴有少量肝细胞变性,且肝损伤率高于DSS组。此外雄性较雌性对何首乌诱导大鼠肝损伤敏感。(2)因此以LPS为激活剂,给予何首乌可见大鼠出现主要毒性症状为腹泻、眼渍,怠动,毛色不滑,随着药物剂量的增大,症状有所加重。依次根据给药剂量大鼠死亡情况为雄性1,0,2,3,5只,雌性1,0,4,4,5只,在给药后2-3天大鼠较空白对照组体重有所下降,14天后给药组大鼠肝脏系数没有明显变化,血液生化检测发现,给药组相对空白对照组转氨酶(ALT、ALP)没有显著性增加。其MTD为30g/kg、MLD为90g/kg、LD50为53.26g/kg,分别相当于临床拟用剂量的150、450和266.3倍,LD50的95%可信限为46.91~60.46g/kg。(3)经单次LPS激活后,随着何首乌给药次数增加,LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠体重减轻。第8天,病理大体检查发现LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠肝脏轻微肿胀。肝脏组织病理学观察可见LPS+PMT-H组显著肝细胞变性、局部慢性炎性灶且肝损伤程度较LPS+PMT-L组严重,PMT-L组及PMT-H组仅见极少量肝细胞变性。APAP组可见肝细胞坏死。而LPS组肝细胞结构恢复正常。LPS+PMT-L和LPS+PMT-H组可见显著肝细胞变性、局部慢性炎性灶,何首乌给药浓度与肝损伤程度正相关。即何首乌致大鼠肝损伤炎症模型建立成功。(4)应用RT-PCR技术对肝脏m TLR4表达水平检测发现,LPS组升高后恢复正常,而经诱导的LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组显著升高,与肝损伤程度正相关。应用i TRAQ技术对模型动物肝脏进行差异表达蛋白筛选,发现gi|13242301|ref|NP_077367.1|该模型差异表达蛋白,其对应基因为estradiol 17-betadehydrogenase 2,对应人源蛋白为HSD17B2。(5)第2小时,与空白对照组相比,尾静脉注射LPS 2小时后,LPS组大鼠血清ALT/ALP,micro RNA-122表达量显著升高(p0.05)。第14小时、第5天、第8天,LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠血清ALT/ALP改变未超过正常值范围。LPS组与Ctrl组大鼠血清micro RNA-122的表达未见显著差异,而在LPS+PMT-L组,LPS+PMTH组,APAP,LPS+APAP组大鼠血清组micro RNA-122显著性增加(P0.05)。此外,与Ctrl组相比,不同时间点各指标,如micro RNA-122、m TLR4相对均值表达情况显示:第8天,与ALT/ALP相比,LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠血清中micro RNA-122和肝脏中m TLR4表达显著上调,且LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组比PMT-L组和PMT-H组升高显著。结论:1.IBD炎症动物模型的建立及治疗药的药效学评价。(1)综合临床观察评分、组织切片观察、细胞因子检测等指标进行分析,急性IBD动物炎症模型建立成功。(2)维生素E可缓解DSS诱导大鼠结肠炎,缓解效果与给药剂量呈正相关。其作用机制可能是通过抗氧化应激调节大鼠结肠IL-12、IL-18、TNF-α分泌,来缓解DSS诱导的大鼠急性IBD。(3)新型选择性CRFR1拮抗剂P16对干预及治疗DSS诱导大鼠结肠炎症状有效。其可能机制与调节促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、TNF-α和IFN-γ密切相关。且给予P16后,大鼠未见显著肝损伤。即P16可作为潜在治疗IBD的药物。2.何首乌致肝损伤炎症动物模型的建立,其可能机制探究及潜在生物标志物micro RNA-122的验证。(1)LPS激活枯否细胞可触发何首乌特异质肝毒性;(2)新型何首乌致大鼠肝损伤模型已经成功建立,与目前常用何首乌致肝损伤动物模型相比,新模型与临床更为相近。(3)新型何首乌致大鼠肝损伤的作用机制与肝脏m TLR4表达水平有关,且损伤程度与肝脏m TLR4的表达呈正相关。(4)与传统血清肝脏生物标志物ALT/ALP相比,血清micro RNA-122变化更灵敏,且表达稳定,可作为该模型潜在血清生物标志物。此外,肝脏m TLR4表达趋势和血清micro RNA-122相似,这也提示m TLR4或许也可作为该模型的潜在的生物标志物。该模型对研究何首乌肝损伤机制及筛选预防及诊断潜在生物标志物具有重要意义。应用i TRAQ技术筛选该模型差异蛋白为gi|13242301|ref|NP_077367.1|,其对应基因为estradiol 17-beta-dehydrogenase 2,对应人源蛋白为HSD17B2。该蛋白作为潜在何首乌致肝损伤生物标志物较ALT/ALP、micro RNA-122和m TLR4相比更灵敏和稳定。同时,该模型对可引起特异质肝损伤的化学药,植物性药材等的肝毒性的研究均有指导意义。
【关键词】：炎症动物模型 炎症性肠病 何首乌肝毒性 维生素E CRFR1
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-13
• Abstract13-20
• 前言20-27
• 第一部分IBD模型的建立及治疗药的药效学评价27-53
• 一．IBD炎症动物模型的建立及E治疗IBD药效学评价28-41
• 材料与方法28-30
• 结果30-40
• 小结40-41
• 二. 新型CRFR1 拮抗剂P16 对IBD炎症动物模型的药效学评价及可能机制 ..3741-53
• 材料与方法41-43
• 结果43-52
• 小结52-53
• 第二部分 新型何首乌致肝损伤动物模型的建立及可能机制的研究53-114
• 一、何首乌致大鼠肝损伤模型激活剂的选择54-63
• 材料与方法55-58
• 结果58-62
• 小结62-63
• 二、LPS激活何首乌致大鼠肝损伤模型急性毒性实验63-67
• 材料与方法63-65
• 结果65-66
• 小结66-67
• 三、新型何首乌致动物肝损伤模型的建立67-76
• 材料与方法67-70
• 结果70-75
• 小结75-76
• 四、LPS激活何首乌致动物肝损伤可能机制76-80
• 材料与方法76-79
• 结果79
• 小结79-80
• 五、潜在生物标志物MICRORNA-122 在LPS激活何首乌肝损伤动物模型中的验证及比较80-87
• 材料与方法80-84
• 结果84-86
• 小结86-87
• 六、LPS激活何首乌肝损伤动物模型肝脏差异蛋白的筛选87-114
• 材料与方法87-92
• 结果92-113
• 小结113-114
• 讨论114-120
• 结论120-122
• 参考文献122-130
• 致谢130-132
• 个人简历132-13

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本文编号：912474