乳杆菌热致死菌体对RAW264.7巨噬细胞炎症反应的调控作用研究

发布时间：2017-09-26 05:28

  本文关键词：乳杆菌热致死菌体对RAW264.7巨噬细胞炎症反应的调控作用研究

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【摘要】：肠道炎症发病率逐年提高,有关其预防和治疗方面的问题已成为国内外重点研究课题,目前对于肠炎的治疗,主要通过药物进行,但药物治疗存在副作用,将益生菌作为生物制剂调节肠道炎症,更具有应用价值。因此,研究实验筛选出的四株干酪乳杆菌M5-L、副干酪乳杆菌Q8-L及鼠李糖乳杆菌L.GG和J10-L的炎症调节作用对其临床治疗应用具有重要意义。本论文首先采用1μg/m L脂多糖(Lps)诱导巨噬细胞,建立细胞炎症模型。然后将四株菌的热致死菌体作用于炎症细胞模型。通过MTT法测定细胞存活率,研究发现:热致死菌体能够增加细胞存活率,Lps存在时的细胞存活率为空白组的61%,加入M5-L、Q8-L、J10-L和L.GG菌株后,细胞存活率分别为预防组:68.9%,70.0%,66.3%,101.8%;共育组:82.12%,65.5%,61.4%,76.7%;治疗组:95.9%,62.2%,64.73%,85.8%。以细胞存活为前提,研究了四种乳杆菌对炎性介质(NO)、促炎(TNF-α,IL-6,IL-1β)和抗炎(IL-10)的调控作用。研究发现:四株乳杆菌热致死菌体均能显著抑制NO,其中L.GG菌株效果最佳,NO含量由阳性对照组278.20 pg/m L降低为预防组122.99pg/m L,治疗组248.28 pg/m L,共育组218.39 pg/m L。同时发现,四株菌均能有效抑制TNF-α的表达,其中Q8抑制效果最佳,TNF-α的表达量由阳性对照组58.95 pg/m L降低为预防组7.90 pg/m L,共育组(3.90 pg/m L),治疗组(8.20pg/m L)。对IL-6和IL-1β的含量,各菌株作用效果不显著,抗炎因子IL-10测定结果显示预防组效果最佳,各菌株均增加至350.00 pg/m L以上。细胞周期测定结果显示,加入Lps后,G0/G1期增加,产生阻滞,使细胞处于增殖活性较低的状态。M5作用的预防组和治疗组中G2/M+S%增加效果显著,共育组中效果不显著。Q8对治疗组中的G2/M+S%增加显著。J10与L.GG均能明显增加G2/M+S%期,同时在预防组和共育组中,S期不同程度的减少。结果表明:乳杆菌能改变细胞周期,使细胞处于分裂旺盛阶段。为进一步测定四种乳杆菌对炎症因子的调控作用,采用RT-PCR方法测定了上游调控因子iNOS、细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA水平表达。研究发现:Lps能使细胞内的iNOSmRNA水平显著提高,Q8、J10菌对iNOS的m RNA水平具有显著抑制作用,L.GG组效果更显著,M菌的作用效果不显著;四株菌株均能有效抑制TNF-α的mRNA水平表达;M菌和J菌能够显著地降低IL-6的mRNA水平表达,其中预防组和治疗组作用效果显著,经L.GG菌作用的治疗组不显著,Q8菌促进了IL-6的分泌。研究结果表明:四种热致死菌体对相关炎症因子的调控作用具有差异性。最后,通过western方法测定四种乳杆菌对信号通路中i NOS和NF-κBp65两种蛋白表达变化的影响。研究发现:M5对细胞炎症具有治疗作用且效果较显著;Q8具有预防和缓解细胞炎症作用;乳杆菌J10不能抑制i NOS的蛋白表达;L.GG菌只对预防组具有抑制作用。NF-κB在Lps作用下被激活,促使下游产生多种细胞因子,加速细胞炎症。M5不能抑制NF-κBp65的表达,Q8的治疗组、J10的预防组和L.GG作用的预防组和共育组治疗效果显著。其余实验组的NF-κBp65水平较高,没有抑制趋势。综上,四种乳杆菌对RAW264.7巨噬细胞炎症反应的调控作用存在菌株特异性和作用时间差异性。
【关键词】：抗炎 乳杆菌 死菌体 巨噬细胞
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3;R574
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-16
• 1.1 乳酸菌与肠道炎症10
• 1.2 乳酸菌对肠道炎症的主要调控途径10-13
• 1.2.1 PPARγ 介导NF-κB途径10-11
• 1.2.2 Toll受体介导的NF-κB/MAPKs途径11-12
• 1.2.3 NOD2受体介导的NF-κB途径12-13
• 1.3 巨噬细胞与肠道炎症13-14
• 1.4 课题研究背景及目的意义14-15
• 1.5 技术路线15-16
• 第2章 材料和方法16-27
• 2.1 实验材料16-19
• 2.1.1 药品与试剂16-17
• 2.1.2 实验仪器17-18
• 2.1.3 菌种和细胞18-19
• 2.2 实验方法19-26
• 2.2.1 菌株处理19
• 2.2.2 RAW264.7 细胞培养19
• 2.2.3 体外细胞炎症模型的构建19-20
• 2.2.4 MTT检测巨噬细胞增殖活性20
• 2.2.5 细胞HE染色观察细胞形态20-21
• 2.2.6 流式细胞术检测乳杆菌对细胞周期的影响21
• 2.2.7 NO试剂盒测定上清液中NO的含量21
• 2.2.8 ELISA法测定上清液中细胞因子的含量21-22
• 2.2.9 RT-PCR测定细胞因子m RNA水平的表达量22-25
• 2.2.10 Western Bloting检测iNOS和NF-κBp65蛋白的表达25-26
• 2.3 统计学分析26-27
• 第3章 乳杆菌热致死菌体对RAW264.7 细胞因子及炎性介质分泌的影响27-45
• 3.1 菌株计数结果28
• 3.2 乳杆菌热致死菌体对细胞活性的影响28-29
• 3.3 乳杆菌热致死菌体对细胞形态的影响29
• 3.4 乳杆菌热致死菌体对巨噬细胞周期的影响29-31
• 3.5 炎性介质NO含量测定结果31-34
• 3.6 细胞上清中促炎因子测定结果34-41
• 3.6.1 乳杆菌热致死菌体对促炎因子TNF-α 的影响34-37
• 3.6.2 乳杆菌热致死菌体对促炎因子IL-6 的影响37-39
• 3.6.3 乳杆菌热致死菌体对促炎因子 IL-1β 的影响39-41
• 3.7 细胞上清中抗炎因子含量的测定结果41-43
• 3.8 本章小结43-45
• 第4章 乳杆菌热致死菌体抗炎作用机制研究45-62
• 4.1 乳杆菌热致死菌体对NF-κB信号通路的调控作用46-55
• 4.1.1 乳杆菌热致死菌体对NF-κB相关细胞因子m RNA水平的调控46-52
• 4.1.2 乳杆菌热致死菌体对NF-κBp65蛋白水平表达的影响52-55
• 4.2 乳杆菌热致死菌体对i NOS-NO表达过程的调控作用55-60
• 4.2.1 乳杆菌对细胞中iNOSmRNA水平表达的影响55-57
• 4.2.2 乳杆菌热致死菌体对i NOS蛋白含量的影响57-60
• 4.3 本章小结60-62
• 结论62-64
• 参考文献64-71
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文71-73
• 致谢73

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本文编号：921770