寻找小分子物质稳定角蛋白结构保护肝损伤的研究

发布时间：2017-09-26 08:06

  本文关键词：寻找小分子物质稳定角蛋白结构保护肝损伤的研究

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【摘要】：背景慢性乙型肝炎、药物性肝损害等其他多种因素可造成我国患者肝脏损伤,在肝损伤发生过程中患者个体之间差异较大,同种病因往往可导致完全不同的转归,因此其他潜在的造成这种个体差异的因素需要进一步探究。角蛋白是三大细胞骨架蛋白中间丝蛋白的最大亚群,它在肝细胞中与肝细胞结构、功能密切相关,特别是研究发现角蛋白基因突变可导致宿主容易造成肝脏损伤,因此它是否作为一种潜在因素影响着患者不同的转归,有待进一步研究。肝脏特异性角蛋白K18 R90C突变造成其结构改变,使表达该类角蛋白的肝细胞变得脆弱且使宿主容易发生肝脏损伤。寻找能够逆转突变角蛋白结构的方法,从而恢复其结构功能,是保护及治疗肝脏损伤的一种新方法。目的本研究希望能够找到逆转突变角蛋白结构的小分子物质,稳定其突变结构,恢复角蛋白功能并为肝脏损伤提供保护,并研究相关小分子物质的保护机制,进一步阐述角蛋白结构改变的原因。本研究为肝脏损伤提供了新的治疗前景,同时也为以肝损伤为代表的“中间丝蛋白相关疾病”的治疗提供了新的方向。并且本研究为将来进一步探究角蛋白是否与肝损伤个体差异有关,以及我国患者中角蛋白突变情况的研究提供了依据。方法本研究将通过以免疫荧光图像为基础的小分子药物筛选方法,寻找能够稳定突变角蛋白结构的小分子物质,在突变细胞及转基因小鼠中分别验证该小分子的结构稳定作用,并将之作为预防性药物检测其在突变细胞和小鼠中的肝损伤保护作用,并进一步通过免疫组化、免疫共沉淀以及重建实验探究小分子物质的作用机制。结果PKC412是一种多蛋白激酶抑制剂,本研究发现它能够改变K18 R90C突变结构,在荧光显微镜下观察发现它能使突变结构恢复到正常的细胞骨架蛋白结构。并且PKC412能够为突变细胞及转基因小鼠提供保护,与未经PKC412处理的细胞相比,其能够减少细胞凋亡相关信号的表达,而与对照组小鼠相比,它能够大大减少急性肝损伤的发生(PKC412处理小鼠平均血清ALT水平为266 U/L,而对照组小鼠平均ALT水平为6546 U/L,P0.05,且HE染色表明PKC412能够减少小鼠急性肝损伤后肝脏出血)。本研究中还进一步探究了PKC412产生保护作用的机制,发现PKC412是通过改变非肌肉型肌球蛋白重链(NMHC)IIA的磷酸化程度,从而调节其与角蛋白之间的结合程度来改变突变角蛋白结构的,而研究中的重建实验进一步表明,PKC412作为蛋白激酶抑制剂对NMHC IIA的磷酸化改变而非对角蛋白的磷酸化改变是其发挥作用的关键。结论本文发现了多蛋白激酶抑制剂PKC412能够逆转突变角蛋白结构,并且能够为突变细胞提供凋亡保护,同时也能减少带有突变的转基因小鼠的急性肝损伤。PKC412的保护作用与其促进K8/K18和NMHC IIA的结合相关,并且受到NMHC IIA的磷酸化调节。
【关键词】：角蛋白 肝损伤 非肌肉肌钙蛋白IIA 磷酸化
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文部分6-50
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 英文缩略词11-12
• 第一章 绪论12-17
• 1.1 课题依据12
• 1.2 中间丝蛋白相关疾病12-14
• 1.3 角蛋白及肝损伤14-16
• 1.4 研究目的16-17
• 第二章 材料与方法17-21
• 2.1 小分子药物的筛选17
• 2.2 细胞凋亡的诱导及免疫组化17-18
• 2.3 动物实验18
• 2.4 免疫荧光及H&E染色18-19
• 2.5 免疫组化标本的制备和角蛋白的提取19
• 2.6 免疫沉淀和重建实验19-20
• 2.7 逆转录PCR20
• 2.8 统计学方法20-21
• 第三章 结果21-35
• 3.1 筛选能够稳定突变角蛋白结构的小分子物质21
• 3.2 PKC412 能够保护细胞减少凋亡发生及小鼠急性肝损伤21-24
• 3.3 PKC412 能够使角蛋白与NMHC-IIA结合增强24-27
• 3.4 NMHC-IIA在PKC412 稳定突变角蛋白结构的作用中是必须的27-28
• 3.5 PKC412 能够抑制NMHC-IIA磷酸化从而促进其与角蛋白的结合28-35
• 第四章 讨论35-38
• 补充图表38-39
• 补充表1 参考文献39-46
• 参考文献46-49
• 总结与展望49-50
• 英文部分50-64
• Abstract50-51
• 1. Introduction51
• 2. Materials and Methods51-55
• 2.1 Mouse experiments51-52
• 2.2 Immunofluorescence and hematoxylin-eosin staining52-53
• 2.3 High throughput screening and analysis53
• 2.4 Cultured cell apoptosis induction, and immunoblotting53-54
• 2.5 NMHC-IIA si RNA treatment54
• 2.6 Sample fractionation and keratin isolation54
• 2.7 Immunoprecipitation and reconstitution experiments54-55
• 2.8 Reverse Transcription-PCR55
• 3. Results55-58
• 3.1 Drug screening for compounds that normalize keratin filament disorganization55-56
• 3.2 PKC412 protects against apoptosis in cultured cells and in mouse liver56
• 3.3 A novel association between keratin and NMHC-IIA is enhanced by PKC412 treatment56-57
• 3.4 NMHC-II Aexpression is required for PKC412-mediated keratin filament normalization57
• 3.5 PKC412-mediated hypophosphorylation of NMHC-IIA enhances its association with K8/K1857-58
• 4. Discussion58-60
• References60-64
• 致谢64-66
• 学术论文和科研成果目录66

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本文编号：922381