咖啡因对斑马鱼脂肪肝的保护作用及其机制的初步研究

发布时间：2017-09-29 09:02

本文关键词：咖啡因对斑马鱼脂肪肝的保护作用及其机制的初步研究

【摘要】：研究背景和目的非酒精性脂肪性肝脏疾病(NAFLD)是引起慢性肝脏疾病最常见的致病因素之一。据估计在西方国家大约20-30%成年人和3-10%儿童青少年存在肝内脂肪过度聚集。最新的系统评价结果显示在中国NAFLD的患病率大约20.09%,男性患病率为24.81%,女性患病率为13.16%。随着世界范围内肥胖及其相关并发症如糖尿病、胰岛素抵抗和高脂血症的流行,NAFLD的发生率在最近几十年逐渐升高。事实上,NAFLD目前被看作是代谢综合征在肝脏内的病理体现,其病变程度包括从非进展的单纯性脂肪变性到伴随气球样变性、炎症浸润或肝纤维化的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。经过几十年的演变,NASH可进展为肝硬化,甚至最终可能发展为肝癌。由于NAFLD的发病分子机制并未完全阐明,目前的主要治疗策略是改变生活饮食习惯和增加身体运动,避免长期静坐。许多实验研究已通过利用饮食诱导、药物诱导和遗传操作方法在啮齿动物中尝试建立NAFLD模型。近年来由于斑马鱼比啮齿动物具有繁殖率高,成熟早,体积小,维护和饲养成本低的特点,斑马鱼成为新的实验动物为研究人员所青睐。越来越多的研究人员利用斑马鱼作为疾病模型来研究NAFLD的发病机理和药物治疗。在一篇综述里Yoichi Asaoka等人概括总结了用于研究NAFLD的各种鱼类模型包括突变的、转基因的、饮食诱导的和化学药物处理诱导的模型,并且与啮齿动物模型进行了比较。Valerie Sapp等人最近利用受精后7天的斑马鱼幼鱼建立了果糖诱导的斑马鱼NASH模型。然而,以往利用斑马鱼模型进行的NAFLD研究大多数是聚焦在受精后5-7天斑马鱼和成熟的斑马鱼,而对于青少年时期的斑马鱼的NALFD模型目前尚未有探索。基于斑马鱼样本量大和在青少年期其身体具有透明性适于运用整体油红O染色来确定其肝内脂质聚集的优点,在本研究中我们试图建立青少年期斑马鱼是否可作为饮食诱导的斑马鱼NAFLD模型。咖啡可能是世界上最常饮用的饮料。由于世界范围内许多国家消费咖啡,无论从公众和科学研究的视角而言,研究咖啡对人类潜在利与弊都是值得关注的。咖啡因是咖啡的主要成分,咖啡也含有其他成分如二萜醇、钾、烟酸、镁和抗氧化剂绿原酸(CGA)、生育酚等。尽管咖啡和咖啡因能增加患心血管疾病的风险,但是越来越多的证据表明咖啡和咖啡因对慢性肝脏疾病具有肝脏保护作用。流行病学和临床研究已表明饮用咖啡和咖啡因可降低酒精性肝硬化、2型糖尿病、NAFLD和肝癌的发生,减缓NASH的进展和降低肝纤维化的严重性及肝损伤患者ALT的活性。许多动物和体外实验研究显示咖啡和咖啡因对肝脏损伤具有保护作用。Sandra kal thoff等人证明咖啡通过上调肝内和胃中尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶表达介导肝保护和抗氧化特性。动物实验研究显示咖啡因能通过抑制转化生长因子p(TGF-p)和其下游效应分子减轻肝硬化和肝癌的发生。咖啡因也可通过激活自噬溶酶体通路降低肝内脂质含量和激活肝细胞内脂质p-氧化。类似的研究表明在HepG2细胞中咖啡因可通过调控AMPK-SREBP信号通路抑制脂质形成和激活脂质分解而有效地降低甘油三酯和胆固醇含量。尽管咖啡和咖啡因对NAFLD显示出肝脏保护作用特性,但是其确切机制并未完全明确。本研究通过建立饮食诱导的斑马鱼幼鱼NAFLD模型,同时探讨咖啡因对斑马鱼幼鱼肝内脂质聚集的影响及可能的机制。从而为研究NAFLD的发病机制和治疗药物的筛选提供实验模型。方法1、确定斑马鱼幼鱼发生脂肪肝的最适喂养量和喂养时间由于斑马鱼具有嗜食性的特点,我们将受精后5天(5dpf)斑马鱼幼鱼分为6个不同喂养量组(20mg/d、30mg/d、60mg/d、80mg/d、120mg/d和 180mg/d),3个不同喂养时间(10天、15天和20天),每组100条幼鱼。通过测量幼鱼的体重和体长评估不同喂养量和喂养时间幼鱼的生长情况,同时统计不同组幼鱼的死亡率。利用整体油红O染色、冰冻切片油红O染色和HE染色评估不同喂养组和喂养时间斑马鱼幼鱼脂肪肝发生率和肝脏病理学的变化。进一步通过检测幼鱼体内甘油三酯和总胆固醇含量,观察不同喂养组幼鱼体内脂质含量的变化。根据斑马鱼幼鱼生长情况、肝脏病理学改变和体内脂质变化,从而确定诱导斑马鱼脂肪肝的最适喂养量和喂养时间,为后续评估咖啡因对脂肪肝的作用提供模型。2、探讨咖啡因(caffeine)对饮食诱导的斑马鱼幼鱼肝脂肪变性的影响为研究咖啡因对斑马鱼肝内脂质聚集的影响,我们将咖啡因添加到幼鱼食物中,将幼鱼分为1%caffeine、2.5%caffeine、5%caffeine、8%caffeine、正常喂养组和过度喂养组,喂养20天。测量不同喂养组幼鱼体重变化情况,整体油红O染色评估各组斑马鱼幼鱼脂肪肝发生率,接着冰冻切片油红O染色和HE染色评估不同喂养浓度咖啡因对幼鱼肝脏脂肪变性的影响。此外,测量各组斑马鱼幼鱼体内甘油三酯和总胆固醇的水平,评估咖啡因对幼鱼体内脂质的影响。3、初步探讨咖啡因(caffeine)减轻斑马鱼幼鱼脂肪肝的可能机制本研究主要通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)在转录水平研究相关基因的表达水平。应用该方法我们检测咖啡因对幼鱼肝内脂质代谢相关基因(PPAR-γ、SREBP1、PPAR-α、ACC1、FASN、CD36、UCP2、CPT-1和ACO)、内质网(ER)应激相关基因(ATF6、IRE1、PERK、BIP和CHOP)、炎症相关基因(IL-1β、TNF-α和NF-κB)和自噬相关基因(Beclin-1、ATG12和ATG3)的表达影响。4、尼罗红荧光染色活体标记和成像过度喂养斑马鱼幼鱼肝内脂滴和体内脂肪组织由于斑马鱼幼鱼身体具有透明可视性,我们通过利用尼罗红荧光染料标记中性脂质的特性,在斑马鱼幼鱼体内活体标记和成像过度喂养幼鱼肝内脂滴聚集和体内脂肪组织。同时利用尼罗红荧光染色方法动态观察不同喂养时间幼鱼体内脂肪组织的分布和肝内脂滴变化。此外,在饥饿和饥饿后喂养条件下,利用该方法活体观察过度喂养的幼鱼体内脂肪组织和肝内脂滴的动态变化。结果1、过度喂养斑马鱼幼鱼明显发生了脂肪肝通过测量不同喂养量和喂养时间幼鱼的体重和体长,结果分析显示幼鱼体重和体长随着每日喂养量的增加逐渐增加,喂养20天幼鱼体重(2.063±1.624mg)明显比喂养15天幼鱼(1.108±0.7363mg)重(P0.001)。同样地喂养20天幼鱼体长(6.587±1.220mm)比喂养10天幼鱼(4.885±0.5879mm)和喂养15天幼鱼(5.594±0.7336mm)明显长(P0.001)。然而,不同喂养组之间幼鱼的死亡率并没有统计学差异(P0.05)；喂养15天(19.25%)和喂养20天(21.47%)幼鱼死亡率明显比喂养10天幼鱼(7.83%)高(P0.01),而喂养15天幼鱼死亡率与喂养20天幼鱼死亡率无统计学差异(P0.05)。这些数据表明幼鱼死亡率与每日喂养量无关,而是取决于幼鱼本身内在的因素。整体油红O染色方法评估显示,随着喂养量的增加,幼鱼脂肪变性率逐渐升高；在每天喂养量120mg/d组和180mg/d喂养组幼鱼脂肪肝发生率可达80%以上,但是在不同喂养时间组之间幼鱼脂肪肝发生率无统计学差异(P0.05)。整体油红O染色、冰冻切片油红O染色和HE染色显示幼鱼喂养10天后出现肝内脂滴聚集,并且当幼鱼喂养到15天和20天后肝内脂滴数量增多,体积增大。然而,每日喂养量为20mg/d或30mg/d组幼鱼肝脏基本上没有脂质聚集,表明该喂养量能维持幼鱼正常的能量需要。而每日喂养量为120mg/d或180mg/d组幼鱼显示肝内大量的脂滴聚集,这表明在该喂养量条件下幼鱼处于能量过剩状态。此外,检测斑马鱼幼鱼体内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)的含量,结果表明180mg/d喂养组幼鱼喂养20天体内TG含量(0.0142±0.0035mmol/gprotein)明显比30mg/d喂养组幼鱼体内TG含量(0.0073±0.0034mmol/gprotein)高(P0.01)),而两组之间总胆固醇(TCH)含量并没有统计学差异(P0.05)。因此,这些数据表明在过度喂养条件下斑马鱼幼鱼易于发生肝脏脂肪变性,同时表明我们成功地建立了过度喂养诱导的斑马鱼幼鱼脂肪肝模型,并将喂养量为30mg/d,喂养20天的幼鱼定位正常喂养组,而喂养量180mg/d,喂养20天的幼鱼为过度喂养组。2、咖啡因降低过度喂养斑马鱼幼鱼肝内脂质的聚集许多流行病学和临床证据已表明咖啡和咖啡因对慢性肝脏疾病具有保护作用,因此我们研究咖啡因在过度喂养的斑马鱼幼鱼中是否具有降低肝内脂肪聚集的作用。首先,我们评估了咖啡因对幼鱼体重的影响。我们发现在2.5%、5%和8%caffeine喂养组幼鱼体重中比过度喂养组幼鱼体重明显减轻,但是在1%caffeine喂养组和过度喂养组之间幼鱼体重没有明显差别。正如幼鱼体重一样,2.5%、5%、8%caffeine喂养组幼鱼脂肪肝发生率和TG含量与过度喂养组比较明显降低,而1%caffeine喂养组和过度喂养组之间无差异。同时各不同喂养组之间总胆固醇含量并没有统计学差异。接着连续冰冻切片HE染色和油红O染色结果显示2.5%、5%和8%caffeine喂养组幼鱼肝内脂滴数量和脂滴体积比1%caffeine喂养组和过度喂养组幼鱼明显减少。这些数据表明咖啡因能减轻过度喂养诱导的幼鱼肝内脂质聚集。3、咖啡因参与调控脂质代谢通路、内质网(ER)应激和炎症反应相关的基因表达为了探索咖啡因减轻肝内脂滴聚集的可能机制,我们检测了参与调控脂质代谢基因的表达水平。qPCR结果显示与过度喂养组幼鱼相比,参与脂肪酸摄入的转运蛋白的基因表达水平在5%caffeine喂养组中明显的降低,如脂肪酸转运酶基因(FAT/CD36);解耦联蛋白-2(UCP-2)基因和参与脂质形成的转录因子基因如固醇调节元件结合转录因子-1(SREBP-1)表达水平也降低；参与脂肪酸合成的关键酶乙酰CoA羧化酶-1(ACC1)和脂肪酸合成酶(FASN)表达含量也明显降低。然而,参与脂肪酸β-氧化过程的乙酰CoA氧化酶(ACO)基因表达水平在5%caffeine喂养组中明显升高。接着我们在过度喂养的幼鱼中探索咖啡因是否能影响ER功能而发挥保护肝脏的作用。qRT-PCR结果显示过度喂养组组中参与ER应激的基因表达水平明显比对照组(30mg/d)升高,包括基因IRE1、BIP和CHOP。咖啡因喂养后,基因BIP和IREl表达量明显下降,并且ATF6和PERK的mRNA水平在咖啡因喂养组中也明显降低,这表明咖啡因可下调参与ER应激的相关基因。进一步我们检测了炎症因子基因的表达水平,观察咖啡因是否可调节炎症反应。结果显示与正常喂养组比较,过度喂养组幼鱼肝组织中炎症因子IL-1β和TNF-α表达含量明显增加；而5%caffeine喂养后其表达含量又明显降低；NF-κB的表达量各组之间没有差异。除此之外,咖啡因处理后自噬相关基因ATG12和Beclin-1的表达水平降低。因此,这些结果表明咖啡因可能通过抑制脂质形成和脂肪酸摄入,改善内置网功能及减轻肝内炎症反应而减轻幼鱼肝内的脂质聚集。4、尼罗红染色活体标记和成像过度喂养幼鱼肝内脂滴和体内脂肪细胞我们选择过度喂养20天幼鱼,经过尼罗红染液处理后,在荧光显微镜下观察。结果发现在幼鱼肝内和腹腔部位有明显的强烈桔黄色信号,表明幼鱼存在肝内脂滴和腹腔脂肪细胞聚集。同时整体油红O染色,白光显微镜和HE切片进一步证实肝内脂滴和腹部脂肪细胞的存在。接着我们运用尼罗红染色观察不同喂养时间幼鱼体内脂肪组织的发生和分布。尼罗红染色结果显示5dpf斑马鱼幼鱼还未被完全吸收的卵黄囊。过度喂养2天的幼鱼(即9dpf)胰腺位置出现中性脂质聚集,表明脂肪细胞最先出现在胰腺部位；喂养5天的幼鱼(12dpf)腹腔中开始出现小脂滴,提示存在脂肪细胞聚集：而随着喂养时间延长腹腔脂肪细胞聚集明显增多,脂肪细胞出现的部位除腹腔外,还出现在其他部位如胸鳍部,眼眶周围,尾鳍部,心包周围,下颌部,皮下和背部。这表明随着喂养时间延长斑马鱼体内脂肪细胞数量和出现部位逐渐增加,说明不同部位脂肪组织的发生并不是同步的,斑马鱼脂肪组织的形成按一定的顺序存在时间和空间上的调控。此外,发现在过度喂养下斑马鱼肝脏在喂养5天后可出现明显的脂质聚集,之后肝内脂质聚集一直存在,表明斑马鱼易于发生肝内脂质聚集。接着我们运用尼罗红纵向观察饥饿后斑马鱼脂肪组织和肝内脂滴变化。首先,尼罗红染色过度喂养的27dpf斑马鱼显示腹腔内脂肪细胞聚集和肝内脂滴形成。而在斑马鱼饥饿1、2和4天后,腹腔脂肪组织明显逐渐减少,肝脏体积和肝内脂滴数量也逐渐减少。在饥饿5天后,腹腔内脂肪组织和肝内脂滴基本消失,表明在饥饿状态时,斑马鱼动用脂肪组织的脂肪和肝内脂质维持能量供应。为了证明斑马鱼在重新给予喂养后脂肪组织重新出现,我们对饥饿5天后斑马鱼给予喂养。尼罗红染色发现喂养2天后,斑马鱼腹腔内又出现小脂滴,在重新喂养5天后,斑马鱼腹腔内中性脂质明显增加,而肝内脂滴变化不是很明显。这表明饥饿的斑马鱼重新喂养后,脂肪细胞可重新聚集脂质。结论1、成功建立饮食的诱导的斑马鱼幼鱼脂肪肝模型,为研究NAFLD发病机制和治疗药物的筛选提供新的动物模型。2、咖啡因可通过降低脂肪酸摄入、脂质合成和炎症相关因子基因的表达,上调脂质氧化相关基因,同时改善内质网功能而减轻斑马鱼幼鱼肝内脂质的聚集。3、尼罗红荧光染色活体标记和成像斑马鱼幼鱼体内脂肪组织和肝内脂滴,为活体观察体内脂肪组织的发育和肝内脂质聚集提供良好的实验方法。
【关键词】：斑马鱼 脂肪肝 咖啡因 尼罗红 脂肪组织 活体成像
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.5
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