Cathelicidin相关抗菌肽（CRAMP）在炎性肠病及哮喘小鼠模型中的免疫调控作用与机制

发布时间：2017-09-29 09:27

  本文关键词：Cathelicidin相关抗菌肽（CRAMP）在炎性肠病及哮喘小鼠模型中的免疫调控作用与机制

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【摘要】：Cathelicidin是一类广泛存在于脊椎动物体内的生物活性多肽,不同物种来源的家族成员cathelin区域高度保守。人与小鼠只发现一种Cathelicidin,分别命名为LL-37与CRAMP,两者在结构、功能和组织分布等方面极为相似。针对LL-37/CRAMP的研究主要集中于其广谱抗微生物活性,显示其在抗感染中发挥直接杀伤、抑制作用。近年的研究表明,LL-37/CRAMP还作为重要的免疫调节分子发挥功能,在炎症、自身免疫病以及肿瘤等疾病中参与调控免疫病理过程。然而,LL-37/CRAMP的作用具有多重性,例如,可通过促进炎性细胞激活与浸润表现促炎症作用,也可阻断TLR激活而发挥炎症抑制作用；此外,在不同的疾病中表现出疾病恶化或保护作用。因此,在不同疾病的特异病理微环境下研究LL-37/CRAMP的免疫调控作用,对于深入了解其病理生理功能、探讨新的疾病干预手段具有重要意义。本课题旨在利用小鼠模型,研究CRAMP在哮喘和炎性肠病中的可能作用,揭示其在不同病理微环境下的功能调控机制,并探讨以其为靶点的治疗干预策略在炎症疾病中的应用潜能。研究主要包括：1.通过基于巨噬细胞RAW264.7的体外细胞实验以及经鼻腔给予小鼠外源性CRAMP的动物体内实验,显示合成的CRAMP可抑制LPS刺激RAW264.7产生TNF,在体内可诱导气道炎性细胞浸润及炎性细胞因子表达；2.以卵清蛋白(OVA)成功诱导了小鼠急性哮喘模型,外源性给予CRAMP影响了气道炎性细胞因子水平、炎性细胞浸润、过敏原特异抗体应答类型与水平、以及肺组织病理变化,显示CRAMP能够加重过敏性气道炎症；3.分别以TNBS及Oxazolone诱导了克隆氏病与结肠炎两种小鼠炎性肠病模型,显示CRAMP在两种不同T细胞应答病理机制主导的肠炎模型中具有显著不同的表达水平,提示可能存在不同的病理角色；4.外源性CRAMP经直肠给药对Oxazolone诱导的小鼠肠炎进行干预,能够通过下调炎性细胞及炎性细胞因子水平、上调组织损伤修复相关基因表达水平等,起到治疗性效果,但未影响T细胞亚型应答；5.以CRAMP经腹腔给药,下调了炎性细胞因子水平及炎性细胞的浸润,但显著增加Oxazolone诱导的小鼠体重损失与死亡；6.成功构建了基于HBcAg病毒样颗粒的抗CRAMP疫苗,通过免疫小鼠获得抗血清并经尾静脉注射对Oxazolone诱导的小鼠肠炎进行被动免疫干预以拮抗异常增高的内源性CRAMP,未发现显著影响小鼠肠炎,提示CRAMP主要是通过影响肠上皮修复而非影响适应性T细胞炎症免疫反应发挥作用。本研究结果显示,抗菌肽CRAMP显著恶化过敏原诱导的气道炎症反应,而局部的外源性的CRAMP给药显著抑制了肠道炎症反应。研究结果强烈提示,靶向CRAMP的治疗性干预需要考虑具体的疾病环境与免疫病理机制；此外,外源性CRAMP局部应用可能成为临床治疗炎性肠病的新的有效手段。
【关键词】：CRAMP 炎性肠病 哮喘 动物模型
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R574;R562.25
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-18
• 1. CRMP的生物学功能和特点10-12
• 2. 哮喘的危害、病理学机制及CRAMP/LL37的可能角色12-14
• 3. 炎性肠病的危害、病理学机制及CRAMP/LL37的可能角色14-16
• 4. 研究思路、目的及意义16-18
• 第一部分 CRAMP在小鼠哮喘急性模型中的干预研究18-40
• 1. 引言18-20
• 2. 试验材料与方法20-29
• 2.1. 实验材料20-22
• 2.1.1. 试验动物20
• 2.1.2. 细胞系20
• 2.1.3. 主要试剂及耗材20-21
• 2.1.4. 主要仪器21-22
• 2.2. 试验方法22-29
• 2.2.1. CRAMP刺激RAW264.7细胞22
• 2.2.2. 小鼠脾淋巴细胞的分离22-23
• 2.2.3. CRAMP滴鼻免疫23
• 2.2.4. 急性哮喘模型的建立23
• 2.2.5. 急性哮喘模型的CRAMP干预23
• 2.2.6. 肺灌洗液的采集和肺部浸润细胞计数23-24
• 2.2.7. 采血和血清制备24
• 2.2.8. 肺灌洗液细胞因子检测24-25
• 2.2.9. 血清IgG1与IgG2a的检测25-26
• 2.2.10. OVA的Biotin标记及血清中OVA特异的IgE检测26-27
• 2.2.11. 肺组织切片,H&E染色及PAS染色27
• 2.2.12. 肺组织切片的半定量打分27-29
• 3. 结果与分析29-37
• 3.1. 合成肽CRAMP生物活性评价29-31
• 3.1.1. CRAMP显著抑制LPS刺激RAW264-7产生TNF-α29
• 3.1.2. CRAMP促进小鼠气道炎性细胞浸润及炎性细胞因子产生29-31
• 3.2. 外源性CRAMP恶化OVA诱导的小鼠急性哮喘炎性应答31-37
• 3.2.1. 模型建立及干预流程31
• 3.2.2. CRAMP加重哮喘模型中炎性细胞的募集31-32
• 3.2.3. CRAMP显著促进哮喘模型小鼠气道炎性细胞因子的产生32-33
• 3.2.4. CRAMP对IgG1/IgG2a的应答偏向无显著影响33-34
• 3.2.5. CRAMP促进OVA特异的IgE产生34-35
• 3.2.6. CRAMP加重OVA诱导的小鼠肺部炎症35-37
• 4. 讨论37-39
• 4.1. 合成肽CRAMP具有良好的体内和体外生物活性37-38
• 4.2. CRAMP对哮喘模型小鼠细胞因子表达的影响38
• 4.3. CRAMP对OVA诱导的气道炎症的影响38-39
• 5. 小结39-40
• 第二部分 CRAMP在小鼠炎性肠病模型中的干预研究40-95
• 1. 引言40-42
• 2. 试验材料与方法42-59
• 2.1 试验材料42-43
• 2.1.1. 试验动物42
• 2.1.2. 试剂及耗材42-43
• 2.2. 试验方法43-59
• 2.2.1. Oxazolone诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型43
• 2.2.2. TNBS诱导的小鼠克隆氏病肠炎模型43
• 2.2.3. CRAMP直肠给药对小鼠Oxazolone肠炎模型的干预43-44
• 2.2.4. CRAMP腹腔给药对小鼠Oxazolone肠炎模型的干预44
• 2.2.5. CRAMP腹腔给药对小鼠TNBS肠炎模型的干预44
• 2.2.6. 小鼠肠组织取材44-45
• 2.2.7. 用于ELISA检测的肠组织匀浆液的制备45
• 2.2.8. 肠组织匀浆液的细胞因子ELISA检测45-46
• 2.2.9. 肠组织总RNA提取46
• 2.2.10. 肠组织mRNA的逆转录及Real-time PCR检测46-48
• 2.2.11. 肠组织切片及H&E染色48
• 2.2.12. 肠组织切片的半定量打分48-49
• 2.2.13. CRAMP刺激小鼠脾细胞的XTT检测49
• 2.2.14. 血清制备及血清中LPS的含量检测49-50
• 2.2.15. 肠组织MPO检测50
• 2.2.16. 脾淋巴细胞Th流式检测50-51
• 2.2.17. 脾淋巴细胞Treg流式检测51
• 2.2.18. 重组嵌合抗肽疫苗质粒的构建51-54
• 2.2.19. 重组嵌合抗肽疫苗的表达纯化54-56
• 2.2.20. 化学偶联抗肽疫苗的构建56
• 2.2.21. 抗CRAMP疫苗的小鼠免疫56-57
• 2.2.22. 抗肽疫苗免疫后的抗血清检测57-58
• 2.2.23. 抗肽血清被动免疫干预Oxazolone诱导的小鼠肠炎58-59
• 3. 结果与分析59-86
• 3.1. CRAMP及其受体Fpr2在不同炎性肠病模型小鼠肠组织中的表达59-60
• 3.2. CRAMP经直肠给药缓解了Oxazolone诱导的小鼠肠炎60-73
• 3.2.1. 模型建立及干预流程60
• 3.2.2. CRAMP提高模型小鼠生存率60-61
• 3.2.3. CRAMP促进模型小鼠体重恢复61-62
• 3.2.4. CRAMP显著降低模型小鼠肠组织单位长度的重量62-63
• 3.2.5. CRAMP显著抑制模型小鼠肠组织炎性细胞因子的表达63-66
• 3.2.6. CRAMP引起模型小鼠肠组织IFN-γ高表达66
• 3.2.7. CRAMP不影响IL-33表达水平66-67
• 3.2.8. CRAMP促进模型小鼠肠组织中组织修复相关基因的高表达67-68
• 3.2.9. CRAMP抑制模型小鼠肠组织中嗜中性粒细胞趋化因子表达68-69
• 3.2.10. CRAMP显著缓解模型小鼠肠上皮损伤与组织炎症69-71
• 3.2.11. CRAMP增加模型小鼠肠组织中MPO水平71-72
• 3.2.12. CRAMP不影响小鼠脾细胞中T细胞水平72-73
• 3.3. 外源性CRAMP经腹腔给药对不同小鼠炎性肠病模型的作用73-81
• 3.3.1. 模型建立及干预流程73
• 3.3.2. CRAMP不引起正常小鼠的明显毒性反应73-74
• 3.3.3. CRAMP降低Oxazolone而非TNBS诱导的炎性肠病模型小鼠生存率74-75
• 3.3.4. CRAMP显著恶化Oxazolone而非TNBS诱导的模型小鼠体重下降75-76
• 3.3.5. CRAMP未引起肠单位长度重量的显著变化76
• 3.3.6. CRAMP抑制Oxazolone诱导小鼠细胞因子mRNA表达但未影响蛋白水平76-79
• 3.3.7. CRAMP抑制Oxazolone诱导小鼠肠组织中组织修复相关因子表达79-80
• 3.3.8. CRAMP引起正常小鼠腹腔中以嗜中性粒细胞为主的炎性细胞聚集80-81
• 3.3.9. CRAMP不影响血清中LPS水平81
• 3.4. 抗CRAMP疫苗构建及抗血清被动免疫干预Oxazolone诱导的肠炎81-86
• 3.4.1. 重组嵌合抗CRAMP VLPs疫苗的构建82-83
• 3.4.2. 化学偶联抗CRAMP疫苗的构建83-84
• 3.4.3. 抗血清的制备及检测84
• 3.4.4. 抗血清被动免疫Oxazolone诱导的炎性肠病模型小鼠84-85
• 3.4.5. CRAMP不影响鼠脾细胞的增殖85-86
• 4. 讨论86-93
• 4.1. CRAMP经直肠给药途径对肠炎的治疗潜能87-89
• 4.2. 腹腔给药途径对CRAMP针对炎性肠病治疗应用的影响89-93
• 5. 小结93-95
• 5.1. CRAMP经直肠给药对肠炎的治疗潜能93
• 5.2. 腹腔给药途径对CRAMP针对炎性肠病治疗应用的影响93-95
• 全文讨论95-97
• 展望97-99
• 参考文献99-104
• 附录104-108
• 致谢108-109
• 个人简介109-111

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本文编号：941281