Sirt1失活通过增加NF-KB的乙酰化来保护TNF-α引起的肝细胞凋亡和肝脏损伤

发布时间：2017-09-30 02:14

  本文关键词：Sirt1失活通过增加NF-KB的乙酰化来保护TNF-α引起的肝细胞凋亡和肝脏损伤

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【摘要】：急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)是各种肝脏疾病发展而来,以肝细胞的大面积凋亡和坏死为主要特点,而最终导致多脏器衰竭的一种临床综合征。虽然急性肝衰竭发病率低,但它的病程凶险,死亡率极高,严重威胁肝病患者的生命安全。因此,探明其中的细胞凋亡的分子机制了解其病理生理过程为寻找新的治疗方案是至关重要的。Sirt1(Sirtuin type 1)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶,为Sirtuins家族成员之一,与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢密切相关(1-5)。NF-κB是一种异二聚体蛋白,一般由两个功能亚单位(即P65和P50)组成,在多数细胞类型,NF-kB在胞浆与抑制性蛋白质结合形成无活性的复合物。当肿瘤坏死因子等作用于相应受体后,可通过第二信使Cer等激活此系统,而病毒感染、脂多糖、活性氧中间体、佛波酯、双链RNA以及前述信息传递途径中活化的RKC、PkA等则可直接激活NF-kB。激活过程是通过磷酸化抑制性蛋白使其构象改变而从NF-kB脱落,使得NF-kB得以活化。活化的NF-kB进入细胞核,与DNA接触,并启动或抑制有关基因的转录。核因子kB(NF-kB)体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和调亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。NF-κB(RelA/p65)在TNF-α引起的肝细胞损伤中起保护作用(6-8)。Sirt1可以使NF-κB(RelA/p65)的310位上的赖氨酸残基脱乙酰化从而抑制NF-κB的转录活性,减少其下游基因的表达促进细胞的凋亡。同时,Sirt1也可以使p53脱乙酰化从而抑制p53的活性而抗凋亡(9)。Sirt1在肝细胞凋亡中的作用目前还没有明确的结论。为此,我们进行了下面一些实验:(1)通过cre-loxp系统我们建立了肝脏特异性敲除SIRT1基因的小鼠。通过分别给Sirt1+/+和Sirt1-/-小鼠内毒素(LPS)10μg/Kg联合D-氨基半乳糖胺(D-Galn)700mg/Kg建立急性肝衰竭模型,观察两组的生存率和转氨酶水平。我们观察到Sirt1+/+小鼠组建模后72小时的死亡率为100%,6h时的转氨酶水平明显升高。而Sirt1-/-小鼠组死亡率为0,转氨酶也较Sirt1+/+组明显降低。(2)在细胞水平,我们分别提取Sirt1+/+和Sirt-/-小鼠的原代肝细胞进行培养,以ACTD20ng/ml联合TNF-α20ng/ml建立损伤模型,发现Sirt-/-组肝细胞的损伤明显小于Sirt+/+组。在对两组进行NF-κB siRNA干扰后我们发现,SIRT1敲出后的这种保护作用消失了。(3)我们使用Sirt1的抑制剂尼克酰胺预处理Sirt+/+小鼠后,建立急性肝衰竭模型。结果显示,尼克酰胺有明显的保护作用,预处理后小鼠的生存率明显提高,病理组织改变明显减轻。(4)通过不同时间点TNF-α预处理后NF-κB乙酰化水平的检测,我们发现Sirt1敲出后NF-κB的乙酰化水平明显增高且消退时间延长。进一步采用EMSA实验验证NF-κB与DNA的结合活性,通过提取不同时间点TNF-α预处理后的细胞核蛋白做EMSA发现,在预处理后的1h到2h Sirt1-/-组NF-κB与DNA的结合远大于Sirt1+/+组。因此,我们得出结论,Sirt1的失活通过增加NF-κB在受到TNF-α刺激后乙酰化的水平来发挥对肝细胞的保护作用。
【关键词】：急性肝衰竭 肝脏 Sirt1 NF-KB
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.3
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 符号及缩略词说明10-12
• 前言12-15
• 第一部分 Sirt1在TNF引起的肝损伤中的作用15-30
• 材料与方法15-19
• 实验方法19-22
• 实验结果22-29
• 小结29-30
• 第二部分 Sirt1的作用依赖调控NF-κB发挥作用30-56
• 材料与方法30-34
• 实验方法34-46
• 实验结果46-55
• 小结55-56
• 结论56-57
• 讨论57-59
• 参考文献59-64
• 致谢64-66
• 学术论文和科研成果目录66

【参考文献】

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1 ;Induction of acute hepatic injury by endotoxin in mice[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2002年04期

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本文编号：945556