miRNA对非酒精性脂肪肝病变的分子调控作用

发布时间：2017-10-03 10:23

  本文关键词：miRNA对非酒精性脂肪肝病变的分子调控作用

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【摘要】：miRNA是体内的一类非编码小分子RNA,通常含有19-25个碱基。研究表明,miRNA高度保守,在多种疾病中均出现特异性的升高或降低。目前已有多种miRNA用于临床检验的疾病标志物。脂肪肝和肝纤维化的发展过程中有多种miRNA参与调控,对于miRNA的深入研究有助于各种肝脏疾病的临床诊断和治疗水平的提高。本研究通过miRNA的体外细胞模型转染和小鼠动物模型的体内转染,分析与脂肪肝和肝纤维化有关的miRNA含量及其所调控的相关蛋白的变化,确定miRNA在肝纤维化和脂肪肝中的分子调控机制。小鼠的脂肪肝模型验证了脂质体作为载体在动物体内肝脏靶向运输miRNA的可行性。肝纤维化发生的主要原因是肝星形细胞(HSC s)的活化。通过检测体外培养的活化HSCs及miR-15b转染的HSCs中miR-15b和抗凋亡因子(Bcl-2)含量的变化发现,经转染的HSCs中miR-15b含量较活化HSCs有大幅度提高,其P0.05具有显著性差异。Bcl-2的mRNA在两组细胞中含量几乎不变,但其蛋白有明显减少。证明miR-15b抑制Bcl-2的nRNA的翻译表达,从而减少Bcl-2,促使HSCs凋亡,对肝纤维化起到控制作用。体外脂肪肝细胞模型和小鼠脂肪肝动物模型实验表明,与正常组比较脂肪肝中miR-130a会出现明显下调(P0.05),脂肪酸合成酶(FAS)及其激活因子PPAR-γ含量增多。当转入miR-130a后,FAS的mRNA水平显著下降(P0.05),而PPAR-γ的mRNA含量基本不变,但其蛋白有所减少。推测miR-130a通过抑制PPAR-γ的mRNA的翻译,减少其蛋白质含量,进而使FAS的mRNA和蛋白含量下调,对脂肪肝过程进行调控。并且动物实验结果表明,miR-130a对于小鼠的脂肪肝具有缓解治疗作用,为miRNA作为小分子核酸药物的可行性提供支持。开创了脂质体载体肝靶向运输miRNA的新方法。同时,脂质体载体肝脏靶向运输miRNA的成功也为进一步优化肝靶向脂质体,使其可以用于更多肝脏疾病的治疗和药物开发提供了实验依据。
【关键词】：脂肪肝 肝纤维化 miRNA 脂质体载体 转染
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 学位论文数据集3-4
• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 符号说明16-17
• 第一章 绪论17-29
• 1.1 肝纤维化的研究概况17-19
• 1.1.1 肝纤维化的简介17-18
• 1.1.2 肝纤维化的研究机制的进展18-19
• 1.2 脂肪肝的研究概况19-21
• 1.2.1 脂肪肝的简介19-20
• 1.2.2 脂肪肝的最新研究进展20-21
• 1.3 miRNA的研究概况21-24
• 1.3.1 miRNA调控机理21-23
• 1.3.2 miRNA与癌症及其他疾病的研究23-24
• 1.3.3 miRNA的靶向运输载体24
• 1.4 miRNA在脂肪肝和肝纤维化中的应用24-28
• 1.4.1 miRNA在脂肪肝中的应用24-25
• 1.4.2 miRNA在肝纤维化中的应用25-28
• 1.5 论文主要研究内容28-29
• 第二章 miRNA调控HSC细胞凋亡对肝纤维化的作用研究29-49
• 2.1 实验研究目的及意义29
• 2.2 实验材料及仪器29-30
• 2.2.1 实验主要仪器29-30
• 2.2.2 实验主要试剂30
• 2.3 细胞的准备与培养30-31
• 2.3.1 细胞复苏30-31
• 2.3.2 细胞传代31
• 2.3.3 细胞冻存31
• 2.4 细胞转染实验31-34
• 2.4.1 miRNA及其同序列荧光标记DNA合成31
• 2.4.2 细胞计数31-32
• 2.4.3 细胞转染32-34
• 2.5 qRT-PCR实验34-37
• 2.5.1 引物设计34-35
• 2.5.2 细胞中RNA提取35-36
• 2.5.3 反转录PCR实验36
• 2.5.4 qPCR实验36-37
• 2.6 Western blot实验37-40
• 2.6.1 细胞总蛋白质提取37
• 2.6.2 Western blot37-40
• 2.7 TUNEL染色实验40
• 2.8 实验结果与讨论40-47
• 2.8.1 细胞转染实验结论40-41
• 2.8.2 qRT-PCR实验结论41-44
• 2.8.2.1 miR-15b的qRT-PCR实验结论41-44
• 2.8.2.2 Bcl-2的mRNA的qRT-PCR实验结论44
• 2.8.3 Western blot实验结论44-45
• 2.8.4 TUNEL染色实验结论45-47
• 2.9 本章小结47-49
• 第三章 miRNA对体外非酒精性脂肪肝细胞的作用研究49-63
• 3.1 研究目的及意义49
• 3.2 实验材料及方法49-51
• 3.2.1 实验主要仪器49-50
• 3.2.2 实验主要试剂50
• 3.2.3 脂肪肝细胞模型的建立与培养50-51
• 3.2.3.1 HepG_2细胞培养51
• 3.2.3.2 建立脂肪肝细胞模型51
• 3.3 细胞转染实验51-52
• 3.3.1 检验脂肪肝细胞模型建立是否成功51-52
• 3.3.2 细胞转染52
• 3.4 qRT-PCR实验52-55
• 3.4.1 引物设计52-54
• 3.4.2 细胞中总RNA提取54
• 3.4.3 qRT-PCR实验程序54-55
• 3.5 Western blot实验55-58
• 3.5.1 提取细胞中总蛋白55-56
• 3.5.2 Western blot56-58
• 3.6 实验结果与讨论58-61
• 3.6.1 脂肪肝细胞模型检测结论58-59
• 3.6.2 qRT-PCR实验结论59-60
• 3.6.2.1 miR-130a的qRT-PCR实验结论59
• 3.6.2.2 FAS和PPAR-γ的mRNA的qRT-PCR实验结论59-60
• 3.6.3 Western blot实验结论60-61
• 3.7 本章小结61-63
• 第四章 miR-130a对非酒精性脂肪肝模型小鼠的作用研究63-75
• 4.1 实验试剂与仪器63-64
• 4.2 动物实验64-65
• 4.2.1 脂肪肝小鼠模型建立64
• 4.2.2 脂质体包裹miR-130a64-65
• 4.2.3 尾静脉注射65
• 4.2.4 动物取材65
• 4.3 qRT-PCR实验65-67
• 4.3.1 RNA引物设计合成65
• 4.3.2 小鼠肝脏组织总RNA提取65-66
• 4.3.3 qRT-PCR实验程序66-67
• 4.4 Western blot实验67-68
• 4.5 实验结果与讨论68-74
• 4.5.1 小鼠体重称量结论68
• 4.5.2 肝脏病理学切片检测结论68-71
• 4.5.3 qRT-PCR实验结论71-72
• 4.5.3.1 miR-130a的qRT-PCR实验结论71
• 4.5.3.2 FAS和PPAR-γ的mRNA的qRT-PCR实验结论71-72
• 4.5.4 Western blot实验结论72-73
• 4.5.5 血清生化检测结论73-74
• 4.6 本章小结74-75
• 第五章 结论与展望75-77
• 5.1 结论75
• 5.2 展望75-77
• 参考文献77-81
• 附录81-83
• 致谢83-85
• 研究成果及发表的学术论文85-87
• 作者和导师简介87-88
• 附件88-89

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 Nadia Panera;Daniela Gnani;Annalisa Crudele;Sara Ceccarelli;Valerio Nobili;Anna Alisi;;MicroRNAs as controlled systems and controllers in non-alcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年41期

2 魏梅娟;魏开鹏;张小曼;张纯瑜;肖子鸿;潘兴南;;血清肝纤维化指标与肝纤维化病理改变的相关性研究[J];中华实验和临床感染病杂志(电子版);2013年06期

3 叶放,赵文霞;中医对非酒精性脂肪肝的研究现状[J];中国中西医结合消化杂志;2003年01期

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本文编号：964656