人羊膜间充质干细胞定位修复四氯化碳诱导小鼠肝损伤的研究

发布时间：2017-10-05 12:40

  本文关键词：人羊膜间充质干细胞定位修复四氯化碳诱导小鼠肝损伤的研究

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【摘要】：肝脏是人体内功能最多的代谢和解毒器官,具有多种生理功能参与体内消化、代谢、解毒和免疫等过程,因此,肝脏损伤可引起动物和人体的衰老病变和其他疾病的发生。目前,严重的肝脏疾病目前还没有找到一种完全能治愈的措施和治疗方法。由于干细胞具有自我更新和多向分化潜能,有望为干细胞移植性治疗提供新来源,是病变组织器官损伤修复的理想首选细胞。近几年研究者们主要将目光集中在胎盘来源的羊膜组织上,不仅其获得取材方便、来源广泛、增殖能力强、免疫原性低,最重要是不受医学伦理道德限制的优点,这也是比胚胎干细胞应用更广泛的主要原因。羊膜包含两种细胞即人羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,其中人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal cells, hAMSCs)起源中胚层属于成体干细胞,具备间充质干细胞特性同时还具有胚胎干细胞特性,此外hAMSCs还具有在体外特定条件下向内、中、外三个胚层分化潜能,是干细胞移植和再生医学的种子细胞。1、经过胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶共同消化羊膜组织获得hAMSCs,培养并观察细胞生长特性、形态特征、解析分裂中期的染色体；再通过免疫细胞化学、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine Staining, DAB)染色、免疫荧光染色、流式细胞术分析表面抗原、定向诱导三胚层分化和RT-PCR检测等方法对培养的细胞进行鉴定。试验结果表明,从人羊膜组织中分离得到纯度很高的间充质干细胞,经过免疫组化波形丝蛋白(vimentin) DAB染色呈现浅红色阳性表达；免疫荧光检测表达间充质干细胞表面标记Vimentin和胚胎干细胞表面标记SSEA-4;流式细胞术测定细胞强阳性表达间质细胞表面抗原CD29、CD49d、CD73,不表达造血干细胞表面抗原CD34、CD45和人白细胞免疫抑制因子HLA-DR;经过免疫细胞化学RT-PCR检测在体外特定条件下可成功诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经样细胞和胰岛样细胞。结果表明hAMSCs可在体外成功分离、纯化、增殖培养并保持稳定的遗传和生物特性,还具有体外三胚层分化潜能。2、以四氯化碳(CCL4)诱导小鼠肝损伤为受试模型,将活体染料Dir和羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记的hAMSCs通过尾静脉注射移植到肝损伤小鼠,观察hAMSCs在小鼠体内迁移归巢情况及移植后治疗效果。结果表明成功建立小鼠肝损伤模型,Dir和CFSE标记hAMSCs分别通过活体成像和冰冻切片免疫荧光观察移植hAMSCs可以迁移归巢到受损的肝脏,iAMSCs移植后对受损小鼠肝功、组织病理学以及分泌白蛋白等方面都有修复作用,肝损伤程度明显改善,治疗效果显著。3、实时荧光定量和蛋白印迹技术检测表明hAMSCs移植后可提高受损肝组织中肝细胞生长因子(HGF)和沉默信息调节因子1 (SIRT-1)的表达,抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和周期性蛋白依赖性激酶抑制因子(P27kip1)的表达,这些基因参与调控肝细胞增殖、再生,细胞凋亡等方面,抑制肝纤维化过程,因此,α-SMA、HGF、SIRT-1、P27kip1可能是肝再生过程中关键基因,且hAMSCs移植后改善CCL4诱导的肝纤维化,抑制细胞凋亡,促进肝细胞有丝分裂,对肝损伤有一定的修复作用,为进一步探索调控肝再生、损伤修复信号通路(机制)及预防肝纤维化提供了新的启示。综上,hAMSCs可在体外分离培养且具有三胚层分化潜能；经过标记的hAMSCs能够迁移归巢到受损肝脏组织,并能通过参与调控肝细胞相关基因对肝损伤有一定的修复作用,为治疗肝损伤疾病等方面提供实验数据和临床依据。
【关键词】：人羊膜间充质干细胞 肝损伤 定位修复 四氯化碳 小鼠
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 1 引言14-25
• 1.1 人羊膜间充质干细胞研究现状14-20
• 1.1.1 人羊膜间充质干细胞的分离培养14-16
• 1.1.2 人羊膜间充质干细胞形态和免疫表型16
• 1.1.3 人羊膜间充质干细胞体外诱导分化体系16-18
• 1.1.4 人羊膜间充质干细胞体内诱导分化体系18
• 1.1.5 人羊膜间充质干细胞免疫原性及免疫调控功能18-20
• 1.2 干细胞治疗肝脏疾病研究进展20-23
• 1.2.1 四氯化碳与肝损伤20
• 1.2.2 干细胞治疗肝脏疾病研究现状20-21
• 1.2.3 肝损伤修复机理的研究21-22
• 1.2.4 移植细胞动物实验是否可归巢到损伤肝脏22
• 1.2.5 间充质干细胞对肝损伤动物模型疗效评估22-23
• 1.3 本研究的目的和意义23-24
• 1.4 技术路线24-25
• 2 实验一 人羊膜间充质干细胞体外分离培养及诱导分化25-48
• 2.1 材料与方法25-30
• 2.1.1 实验材料25
• 2.1.2 仪器设备25
• 2.1.3 实验试剂25-26
• 2.1.4 实验方法26-30
• 2.2 实验结果30-45
• 2.2.1 不同浓度Ⅰ型胶原酶消化分离人羊膜间充质干细胞形态比较30-32
• 2.2.2 比较不同冻存液对人羊膜间充质干细胞复苏效果32-33
• 2.2.3 人羊膜间充质干细胞的生长曲线33-34
• 2.2.4 人羊膜间充质干细胞染色体数目分析34-35
• 2.2.5 流式细胞仪检测标记抗原35-37
• 2.2.6 免疫细胞化学染色37-38
• 2.2.7 免疫荧光检测表面标记蛋白38-39
• 2.2.8 向脂肪细胞诱导分化及鉴定39-40
• 2.2.9 向成骨细胞诱导分化鉴定40-41
• 2.2.10 向神经细胞诱导分化鉴定41-43
• 2.2.11 向胰岛样细胞诱导分化鉴定43-44
• 2.2.12 RT-PCR检测hAMSCs诱导后细胞44-45
• 2.3 讨论45-47
• 2.4 小结47-48
• 3 实验二 人羊膜间充质干细胞定位修复小鼠肝损伤模型48-62
• 3.1 材料与方法48-52
• 3.1.1 实验材料48
• 3.1.2 仪器设备48-49
• 3.1.3 实验试剂49
• 3.1.4 实验方法49-52
• 3.2 实验结果52-59
• 3.2.1 移植人羊膜间充质干细胞在小鼠肝脏体内示踪(活体成像)52-54
• 3.2.2 CFSE标记人羊膜间充质干细胞结果54
• 3.2.3 小鼠肝损伤模型的建立54-55
• 3.2.4 比较hAMSCs移植前后小鼠肝组织病理学变化55-56
• 3.2.5 hAMSCs移植前后小鼠肝功能变化56-58
• 3.2.6 CFSE标记的hAMSCs的肝内分布定植58-59
• 3.2.7 免疫荧光检测细胞移植后小鼠肝Alb的表达59
• 3.3 讨论59-61
• 3.4 小结61-62
• 4 实验三 人羊膜间充质干细胞移植促进肝损伤修复的作用与机制62-76
• 4.1 材料与方法62-67
• 4.1.1 实验材料62
• 4.1.2 仪器设备62
• 4.1.3 实验试剂62-63
• 4.1.4 实验方法63-67
• 4.2 实验结果67-73
• 4.2.1 RT-PCR检测HGF、SIRT-1、α-SMA、P~(27kip1)mRNA表达67-68
• 4.2.2 RT-qPCR产物特异性检测68-71
• 4.2.3 RT-qPCR检测相对定量结果71-72
• 4.2.4 Western blot检测72-73
• 4.3 讨论73-75
• 4.4 小结75-76
• 5 结论76-77
• 致谢77-78
• 参考文献78-88
• 作者简介88

【参考文献】

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本文编号：976870