LRP1介导的α-MMC肝细胞毒性发生机制研究

发布时间：2017-10-08 03:04

  本文关键词：LRP1介导的α-MMC肝细胞毒性发生机制研究

  更多相关文章： α-MMC 肝细胞毒性 LRP1 细胞凋亡 信号转导

【摘要】：研究背景α-MMC是从苦瓜籽中提取并分离出的I型核糖体失活蛋白,能失活核糖体而诱导肿瘤细胞和病毒感染的细胞凋亡,具有显著的抗肿瘤、抗病毒等多种药理活性,但其体内应用时也出现了明显的肝功能异常等细胞毒性,从而阻止了临床应用。探讨α-MMC肝细胞毒性机制,以改善毒性并保障安全用药是发挥其抗肿瘤作用的前提。研究目的以L02正常肝细胞株为实验对象,探明LRP1介导的α-MMC肝细胞毒性发生机制。材料与方法采用CCK-8试剂检测α-MMC诱导正常肝细胞L02、正常乳腺细胞MCF-10A、正常肾细胞AD293、正常肺细胞BEAS-2B的增殖率以计算各细胞的半数抑制率IC50,并对α-MMC诱导L02细胞的细胞凋亡进行形态学观察及流式细胞仪检测凋亡率;之后对α-MMC进行FITC标记,于激光共聚焦显微镜下观察FITC-α-MMC进入L02、BEAS-2B及AD293的图像;以放射性配体分析实验验证α-MMC的细胞膜受体并计算受体密度及结合亲和力;最后以siRNA法沉默L02细胞上的LRP1蛋白表达,观察α-MMC的细胞毒效果及在不同时间点对早期凋亡蛋白的诱导作用。实验结果(1)α-MMC作用于L02、BEAS-2B、MCF-7、MCF-10A、AD293细胞的IC50分别为5.077±1.03μg/ml、15.03±2.26μg/ml、30.19±2.45μg/ml、77.43±2.54μg/ml和104.9±4.73μg/ml。α-MMC能明显诱导细胞凋亡。(2)激光共聚焦显微镜术可观察到α-MMC在4h后可进入L02、BEAS-2B、AD293细胞。在L02细胞内其荧光强度最强,BEAS-2B细胞次之,AD293细胞最弱。2倍摩尔量的α2-M能明显减弱FITC-α-MMC在L02细胞中的亮度。(3)放射性配体结合分析可看到α-MMC与L02细胞的特异性结合,其亲和力Kd值为47.1±7.54 nM/L,L02、BEAS-2B和AD293细胞的受体密度分别为14260.7±1422.8个/cell、7823±447.5个/cell和872±91个/cell。(4)对L02细胞的LRP1进行基因沉默(siRNA)后,其α-MMC的IC50升高为173.6±3.79μg/ml,α-MMC细胞进入量也明显减少。α-MMC作用于L02细胞后,凋亡蛋白JNK、Bad蛋白、P53蛋白和活化Caspase9蛋白被激活而明显升高,而经siRNA处理后,JNK、Bad、Active Caspase9和P53信号蛋白的活化被显著抑制。结论α-MMC对体外培养的肝细胞L02有较强的细胞毒性,这种毒性作用是通过诱导细胞凋亡达到的;α-MMC可通过与细胞膜特异性受体LRP1结合而被介导入胞,该受体密度越高,α-MMC进入细胞的量就越多,对细胞的毒性也越大;α-MMC也可以通过LRP1介导的JNK信号通路诱导细胞凋亡。由此我们推导出α-MMC的肝细胞毒性机制,即通过LRP1受体介导的α-MMC内吞和JNK信号传到通路两条途径诱导肝细胞凋亡,从而导致肝细胞死亡。
【关键词】：α-MMC 肝细胞毒性 LRP1 细胞凋亡 信号转导
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 第一部分 α-MMC对肝细胞的毒性作用及其机制13-27
• 1 引言13
• 2 实验材料13-16
• 2.1 实验药品、细胞株及试剂13-14
• 2.2 主要仪器14-15
• 2.3 主要配置溶液15-16
• 3 实验方法16-20
• 3.1 细胞冻存16-17
• 3.2 细胞复苏17
• 3.3 细胞培养与传代17-18
• 3.4 细胞计数18
• 3.5 蛋白浓度测定18
• 3.6 SDS-PAGE及银染18-19
• 3.7 细胞毒实验19
• 3.8 L02细胞凋亡实验19-20
• 4 实验结果20-25
• 4.1 α-MMC银染染色结果图20-21
• 4.2 蛋白浓度测定21-22
• 4.3 α-MMC的细胞毒实验结果22-23
• 4.4 细胞凋亡形态学观察23-24
• 4.5 流式细胞仪测定细胞凋亡率24-25
• 5 讨论25-27
• 第二部分 α-MMC受体介导的内吞途径研究及其受体确认27-49
• 1 引言27
• 2 实验材料27-30
• 2.1 试剂27-29
• 2.2 主要仪器29
• 2.3 主要配置溶液29-30
• 3 实验方法30-37
• 3.1 α-MMC细胞膜特异性受体确认及其结合亲和力测定30-31
• 3.2 α-MMC受体介导内吞实验31-33
• 3.3 α-MMC受体介导内吞阻滞实验33-37
• 4 实验结果37-46
• 4.1 放射性配体结合分析37-40
• 4.2 α-MMC进入细胞的图像40-42
• 4.3 WB法筛选实验结果42-43
• 4.4 免疫荧光法对siRNA(编号为C)的基因沉默效果再确认43
• 4.5 LRP1基因沉默对α-MMC细胞毒性的抑制作用43-44
• 4.6 LRP1基因沉默对α-MMC内吞入胞的阻滞作用44-46
• 5 讨论46-49
• 第三部分 α-MMC受体介导的细胞凋亡信号转导研究49-56
• 1 引言49
• 2 实验材料49
• 2.1 试剂及材料49
• 2.2 主要仪器49
• 2.3 主要溶液配置49
• 3 实验方法49-51
• 3.1 α-MMC细胞凋亡信号转导实验49-51
• 3.2 α-MMC细胞凋亡信号转导阻滞实验51
• 3.3 数据处理51
• 4 实验结果51-54
• 4.1 α-MMC细胞凋亡信号转导作用51-52
• 4.2 α-MMC细胞凋亡信号转导阻滞作用52-54
• 5 讨论54-56
• 结论56-57
• 参考文献57-61
• 文献综述61-75
• 参考文献71-75
• 附录75-77
• 攻读学位期间的研究成果77-78
• 致谢78

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王东生,袁肇凯,郭志华;细胞凋亡与中医药[J];中国中医药信息杂志;2000年12期

2 万晓艳,于苏国,郭玉芹,何庆;细胞凋亡与自身免疫性甲状腺疾病的研究进展[J];中国地方病防治杂志;2002年06期

3 祝伟民,林建棣,马晓东,段小平;运动与细胞凋亡[J];中国临床康复;2004年27期

4 王会玲,景文莉,张小红,高维娟;细胞凋亡与心肌缺血-再灌注损伤[J];承德医学院学报;2005年04期

5 梁薇;细胞凋亡的中药调节机制[J];四川中医;2005年11期

6 张松彪;细胞凋亡与细胞养生[J];中国科技产业;2005年01期

7 杨竹林,伍汉文;细胞凋亡调控因素有关基因的研究[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);1997年02期

8 刘恩梅,杨锡强;细胞凋亡及其影响因素[J];重庆医学;1998年01期

9 ;美开发调控细胞凋亡药物[J];中国肿瘤;1999年07期

10 管孝鞠,廖明阳;细胞凋亡在致畸中的作用[J];卫生毒理学杂志;2000年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 陈颖丽;李前忠;;不同亚细胞位置的细胞凋亡蛋白质的结构特性分析[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年

2 孙英丽;赵允;朱山;翟中和;;植物细胞凋亡及其机理的研究[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年

3 刘二龙;袁慧;;锌与细胞凋亡[A];2003全国家畜内科学学术研讨会论文专辑[C];2003年

4 邱洁;高海青;;锌在细胞凋亡中的作用研究进展[A];山东省微量元素科学研究会第三届学术研讨会论文汇编[C];2006年

5 俞雅萍;;细胞凋亡的机制及途径和影响因素[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年

6 于青;袁伟杰;姚建;;晚期糖基化终末产物引起足细胞凋亡的机制[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年

7 季宇彬;尹立;汲晨锋;;调控细胞凋亡的线粒体因素[A];肿瘤病因学研究与中西医结合肿瘤综合诊疗交流研讨会论文集[C];2009年

8 吴经纬;汤长发;;运动中细胞凋亡的线粒体变化特征[A];湖南省生理科学会2006年度学术年会论文摘要汇编[C];2007年

9 蒲小平;李长龄;屠鹏飞;宋志宏;;中药肉丛蓉成分抗神经细胞凋亡的实验研究[A];第七届全国生化药理学术讨论会论文摘要集[C];2000年

10 江键;宋诚荣;崔黎丽;方影;王小平;;静电场对细胞凋亡作用的初步探讨[A];中国物理学会第九届静电学术年会论文集[C];2000年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 商东;“细胞凋亡”与临床医学[N];中国医药报;2001年

2 张志军;细胞凋亡与中医药[N];中国医药报;2002年

3 ;“细胞凋亡疗法”正逐步成为治疗癌症的新途径[N];中国高新技术产业导报;2002年

4 记者张建松;治疗癌症新途径：细胞凋亡疗法[N];科技日报;2002年

5 李明辉;“细胞凋亡”治癌症[N];医药导报;2002年

6 洪敏;细胞凋亡研究引人关注[N];中国医药报;2008年

7 陶春祥;细胞凋亡对心脏疾病的影响[N];中国医药报;2003年

8 本报实习记者 梁媛媛;薛定：发现癌症“开关”[N];北京科技报;2010年

9 高书明;诱导癌细胞凋亡[N];中国医药报;2004年

10 勇汇;中药诱导癌细胞凋亡研究进展[N];中国医药报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 杨利;系列多氮类化合物的抗肿瘤活性研究[D];武汉大学;2012年

2 张浩;从分子、细胞和动物水平研究铅诱发氧化损伤及细胞凋亡的效应与机理[D];山东大学;2015年

3 何欣怡;家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）抑制家蚕BmN细胞凋亡的功能研究[D];浙江大学;2015年

4 冯全服;从线粒体途径研究川芎嗪诱导HepG2细胞凋亡效应机制[D];南京中医药大学;2015年

5 张晓倩;高糖诱导Bim蛋白高表达而促肾近曲小管上皮细胞凋亡的机制探讨[D];山东大学;2015年

6 孙健玮;PTEN基因负调控Raf1磷酸化的作用及其对PC3细胞凋亡的影响[D];昆明医科大学;2014年

7 徐林艳;肿瘤细胞凋亡过程中TNFRSF10B和CFLAR调控机制研究[D];山东大学;2015年

8 樊庆端;生物调控网络的建模与动力学行为研究[D];上海大学;2015年

9 王德选;WNK_3对钠氯协调转运子的调节及在胚肾细胞凋亡中的保护作用[D];南方医科大学;2015年

10 叶嘉;Nogo-B在急性肺损伤肺泡上皮细胞凋亡中的作用[D];第二军医大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 曹璐璐;2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)对人胚肾细胞(HEK293)的毒理效应及作用机制研究[D];中国科学院烟台海岸带研究所;2015年

2 张薇;蒜头果蛋白诱导HepG-2细胞凋亡的研究[D];云南民族大学;2015年

3 唐建国;视黄醇X受体出核抑制对神经元细胞凋亡的影响[D];福建医科大学;2015年

4 安璐;3-氯-1,2-丙二醇细胞毒性及其诱导HEK293细胞凋亡途径探究[D];江南大学;2015年

5 杨翔;Procaspase-8的异常表达抑制TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡[D];昆明理工大学;2015年

6 张昌明;I3C通过调控p53泛素化对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响[D];延边大学;2015年

7 彭涵;共轭亚油酸对仔猪脂肪细胞凋亡的影响[D];西南大学;2015年

8 李立辉;ΔFosB通过MMP-9调控山羊乳腺上皮细胞凋亡的分子机制[D];西北农林科技大学;2015年

9 杨鑫铖;Hedgehog信号通路在大鼠急性胰腺炎腺泡细胞凋亡中的作用[D];河北医科大学;2015年

10 贾琼琼;MicroRNA-214对H_2O_2损伤L6骨骼肌成肌细胞增殖和凋亡的影响[D];河北医科大学;2015年

，

本文编号：991598