重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

发布时间：2016-10-08 13:09

本文关键词：重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

《天津医科大学》 2012年

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

赵倩

【摘要】：目的：血友病A是由于遗传性凝血因子Ⅷ基因缺陷,造成血浆凝血因子Ⅷ含量不足或功能缺陷,引起的一组终身出血的凝血障碍性疾病。凝血因子Ⅷ是治疗血友病的唯一有效用药,它的生产原料就是血浆,而血浆的严重不足造成了目前凝血因子Ⅷ一药难求的局面,也使有些患者不治而亡。血友病A的治疗主要包括血浆来源的凝血因子Ⅷ(plasma-derived FⅧ, pdFⅧ)和重组凝血因子Ⅷ (recombinant FⅧ, rFⅧ)制剂。重组凝血因子Ⅷ制剂的问世是血友病治疗史上的一大突破,由于生产工艺繁琐、价格昂贵其生产仅限于发达国家。目前国内对血友病A的治疗仍以血浆凝血因子Ⅷ浓缩剂为主,然而接受这类血液制品的患者其感染病毒性肝炎及艾滋病等传染性疾病的风险较高。重组凝血因子Ⅷ在生化、免疫、凝血活性及药物动力学等方面与血浆来源的凝血因子Ⅷ无明显差别,但其在纯度、抗原性、安全性、无自身血源性病毒感染等方面具有血浆来源的凝血因子Ⅷ无法比拟的优点,具有良好的应用前景。面对目前国内凝血因子Ⅷ的短缺,利用基因工程生产重组凝血因子Ⅷ成为解决其短缺的一个重要方法。B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ (B domain-deleted human FⅧ, BDDhFⅧ)与野生型凝血因子Ⅷ具有相同的生物学特性,但B区缺失型凝血因子Ⅷ却解决了载体包装容量的限制,且表达产物的结构更为简单。本研究通过构建含有BDDhFⅧ的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法：参照GenBank人凝血因子Ⅷ基因序列设计引物并加入限制性内切酶位点及6个组氨酸。PCR扩增产物和pcDNA4/v5-his空载体分别经Nhe Ⅰ和XhoⅠ双酶切,0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收后将BDDhFⅧ基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞。同时pcDNA4/v5-his空载体电转入HepG2细胞作为对照组。HepG2细胞经300μg/ml Zeocin筛选构建稳定细胞株,并分别收集24h,48h,96h及144h HepG2细胞培养液Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达。结果：经限制性酶切和测序鉴定,成功构建了pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ重组真核表达质粒。在电击转染HepG2细胞后,通过Western blot检测证实,成功在HepG2细胞表达约160KD的重组人凝血因子Ⅷ。分别在24h,48h,96h及144h,收集pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ转染HepG2细胞构建的稳定细胞系培养液,经Western blot检测可见,96h时细胞培养液中重组蛋白分泌最多,而144h时重组蛋白出现部分降解。故收集96h pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ转染组及空载体pcDNA4/v5-his转染组HepG2细胞培养液进行Ni-NTA纯化,纯化样本变性后Western blot检测经光密度比对可见pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ转染组细胞培养液Ni-NTA纯化后条带明显比未纯化的HepG2细胞培养液的条带密度高。且洗脱液2(Elution2)是光密度值最高的,而空载体pcDNA4/v5-his转染组未见条带。结论：本实验选择载体pcDNA4/v5-his构建含有BDDhFⅧ的重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ,利用电转染法转入HepG2细胞,获得表达人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并通过纯化得到大量的重组蛋白,这为进一步研究凝血因子Ⅷ奠定了实验基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R554.1
【目录】：

下载全文更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库前1条

1 邱龄,肖传实,曾秋棠,李茂莲,王改玲,赵文燕;重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建和鉴定[J];山西医科大学学报;2005年05期

【共引文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 肖春红;司力;钱浩;;肾病综合征患者血浆v WF、AT-Ⅲ及D-二聚体的变化分析[J];安徽医药;2009年02期

2 陈勤奋;李佩;谢毅;杨李辉;乌宇波;顾艳;谈婕瑾;郑鹤清;;获得性多凝血因子抑制物所致出血的输血处理分析[J];中国输血杂志;2008年12期

3 陈勤奋;李佩;谢毅;杨李辉;乌宇波;顾艳;谈婕瑾;郑鹤清;;原发性纤溶症22例临床分析[J];中国输血杂志;2009年02期

4 王宗奎;林方昭;肖小璞;李长清;;蛋白C、蛋白S的研究与应用[J];中国输血杂志;2010年04期

5 蒋海燕;刘利军;何海英;;新生儿出血症的研究进展[J];包头医学院学报;2012年03期

6 周玉明;宿振国;彭新国;安新业;;血浆D-二聚体水平与急性脑梗死的相关性研究[J];滨州医学院学报;2011年01期

7 吴华;陆秋莲;彭晋红;张志慧;;低分子肝素动脉端给药在血液透析中的应用效果评价[J];当代护士(学术版);2011年09期

8 李国瑞;;彩色多普勒超声诊断下肢深静脉血栓的应用价值[J];中国医师杂志;2006年03期

9 于新发;周成宇;陈小伍;;经腘静脉介入性尿激酶溶栓治疗下肢深静脉血栓的临床研究[J];南方医科大学学报;2009年09期

10 郑文亮;CRP与FIB在急性冠状动脉综合征中的预测价值[J];临床医学;2004年08期

中国重要会议论文全文数据库前6条

1 王鸿利;张利伟;丁秋兰;王学锋;;原发性纤溶症的诊断和鉴别诊断[A];第十一届全国血栓与止血学术会议暨血栓栓塞性疾病（血栓与止血）基础与临床研究进展学习班论文摘要汇编及学习班讲义[C];2007年

2 宋善俊;方峻;;增强认识，深化研究，，提高药物相关性血栓病防治水平[A];第十一届全国血栓与止血学术会议暨血栓栓塞性疾病（血栓与止血）基础与临床研究进展学习班论文摘要汇编及学习班讲义[C];2007年

3 黄晓雪;包海鹰;李玉;;僵蚕升华物的研究[A];第八届海峡两岸菌物学学术研讨会论文集[C];2007年

4 邓常青;杨静;梁燕;张淑萍;;补阳还五汤及有效部位生物碱和苷对大鼠动脉血栓形成血浆TXA_2、PGI_2的影响[A];中华中医药学会血栓病分会成立大会暨首届血栓病学术研讨会论文集[C];2007年

5 张玲;;妇产科患者留置针护理体会[A];2014年河南省妇产科护理安全管理研讨班论文集[C];2014年

6 蒋名丽;;1例新生儿败血症并发深静脉血栓的护理[A];2014年河南省儿科优质护理服务规范管理培训班及学术交流会论文集[C];2014年

中国博士学位论文全文数据库前10条

1 阎亮;桃红四物汤对THR术后血液高凝状态的影响及DVT预防的实验和临床研究[D];广州中医药大学;2011年

2 邓云;知母有效成分对脑缺血的保护作用及其机制研究[D];北京中医药大学;2004年

3 谢露;广西海带多糖LO1提取纯化与抗血栓作用机制研究[D];广西医科大学;2005年

4 邱龄;腺病毒介导的重组人HIF-1α基因诱导大鼠后肢缺血骨骼肌组织血管再生的作用[D];华中科技大学;2006年

5 黎渊弘;短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的生物化学、药理学和分子生物学的研究[D];广西医科大学;2007年

6 沙吉旦·阿不都热衣木;肿瘤、糖尿病、高血压、冠心病等复杂性疾病血栓前状态的中、维、西医研究[D];新疆医科大学;2008年

7 王蕊;急性心脑血管血栓性疾病与组织因子途径改变的关系研究[D];新疆医科大学;2008年

8 李奇;沙蚕蛋白酶及同工酶的分离纯化、性质及药用生物活性研究[D];吉林大学;2008年

9 张大伟;静脉血栓栓塞症易栓因素的研究及与中医证型的相关性分析[D];山东中医药大学;2008年

10 高辉;联合应用雷洛昔芬和雌激素对去势大鼠血栓前状态的影响[D];中国协和医科大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库前10条

1 陈梅;增龄对血小板参数及活化指标的影响及干预研究[D];泰山医学院;2010年

2 崔翰博;补阳还五汤干预代谢综合征血栓前状态的实验研究[D];山东中医药大学;2010年

3 王丽洁;凝血因子Ⅶ检测试剂的研制[D];北京协和医学院;2010年

4 唐景财;可口革囊星虫纤溶酶的分离纯化及其性质的研究[D];广西医科大学;2011年

5 白旭;狼疮性肾炎患者血浆sTM和sEPCR的临床意义[D];广西医科大学;2011年

6 王佳媛;急性脑梗死患者血小板CD62p与纤维蛋白原的变化[D];吉林大学;2011年

7 杜志山;大鼠TDVT血细胞中Cathepsin S表达变化的实验研究[D];昆明医学院;2011年

8 郑燕科;血细胞中HMOX-1基因变化预测诊断DVT的实验研究[D];昆明医学院;2011年

9 黄永翔;益气活血法治疗气虚血瘀型房颤的疗效观察[D];广州中医药大学;2011年

10 何希瑞;独一味环烯醚萜苷单体化合物制备、止血活性筛选及其机制研究[D];兰州大学;2011年

【相似文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 丁培芳,王潍,申法奎,张心声,滕彬,张雪芹,张梅红,宋玮;获得性凝血因子Ⅷ缺乏10例[J];山东医科大学学报;2001年05期

2 李蓓,吴振军,李广伦;凝血因子Ⅷ、Ⅸ同时缺乏1例[J];中国输血杂志;2004年06期

3 刘燕玉;全血保存凝血因子Ⅷ改变的探讨[J];福建医药杂志;2001年02期

4 赵艳华;凝血因子Ⅷ研究和应用的现状与前景[J];生物技术通讯;2002年06期

5 顾天成;克隆凝血因子Ⅷ[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1986年02期

6 Kaufman RJ ,刘晓宇;重组凝血因子Ⅷ的表达及结构功能分析[J];国外医学.输血及血液学分册;1993年05期

7 李葭灰,刘河芬,韩小琦;一例老年获得性凝血因子Ⅷ减少症的护理[J];中华护理杂志;2000年04期

8 吕慎诚;徐进;景明;;凝血因子Ⅷ复合物的纯化[J];中国输血杂志;1993年01期

9 杨江存;叶世辉;李芒会;任健康;;库存全血凝血因子Ⅷ、Ⅸ活性改变的研究[J];现代检验医学杂志;2006年01期

10 赵威;;凝血因子平行稀释试验在筛选凝血因子Ⅷ抑制物中的应用[J];实用医学杂志;2006年02期

中国重要会议论文全文数据库前1条

1 邱波;华宝来;苏薇;范连凯;李魁星;赵永强;;血栓弹力图在监测凝血因子Ⅷ治疗血友病A中的作用[A];中华医学会血液学分会第十三届全国血栓与止血学术会议暨“血栓栓塞性疾病（血栓与止血）基础与临床研究进展”论文摘要汇编及学习班讲义[C];2011年

中国重要报纸全文数据库前10条

1 范又;[N];光明日报;2007年

2 赵玲;[N];中国医药报;2007年

3 张东风;[N];中国中医药报;2007年

4 王苏平;[N];健康报;2007年

5 驻京记者王丹;[N];医药经济报;2007年

6 驻京记者王丹;[N];医药经济报;2007年

7 王乐民;[N];健康报;2007年

8 王乐民;[N];健康报;2007年

9 实习生申梦霞;[N];科技日报;2010年

10 本报记者朱国旺;[N];中国医药报;2014年

中国硕士学位论文全文数据库前3条

1 赵倩;重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达[D];天津医科大学;2012年

2 王泽;凝血因子Ⅷ在毕赤酵母中的表达[D];河南师范大学;2011年

3 邱波;血栓弹力图在监测凝血因子Ⅷ治疗血友病A中的作用[D];北京协和医学院;2011年

中国知网广告投放