CEPO对PCI术后患者血清致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2021-03-18 22:43

  背景和目的： 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）已经成为全球发病率最高的致死性心脏疾病，其病理变化往往是在冠状动脉发生粥样硬化的基础上继发急性血栓，致使冠状动脉血供急剧减少甚至血流中断，造成相应的供血心肌持久而严重地急性缺血，从而引起大量心肌细胞死亡。目前，临床上广泛开展的经皮冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention，PCI）能够快速恢复急性缺血心肌的血液灌注，最大程度地挽救濒临死亡的心肌细胞，是限制心肌梗死面积、改善患者预后的关键，也已成为急性心肌梗死的最佳治疗策略。但是，在急性心梗的抢救和治疗过程中，罪犯血管重新恢复血液供应后，过量的自由基等攻击重新获得血液供应的这部分组织内的细胞，会造成进一步的再灌注损伤，临床表现为：心肌顿抑、再灌注性心律失常、微循环障碍及致死性再灌注损伤。这些损伤会导致左心室收缩功能减弱、左室内压降低等心肌功能的抑制。 目前，缺血再灌注损伤的机制尚未完全明确。已有众多学者分别进行了大量的动物实验和临床研究，许多研究均从不同方面减轻了再灌注损伤，得出了令人鼓舞的结论，另外，分子水平领域的相关机制研究仍在继续，这也将有助于人们发现新的缺血再灌注保护介质。 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种由缺氧诱导因子家族诱导产生的多功能细胞因子超家族成员。氨甲酰化促红细胞生成素(carbamylatederythropoietin，CEPO)是促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)的一种衍生物。EPO和CEPO通过调节炎症、抗凋亡、促血管生成、保护神经细胞、刺激心肌细胞增殖分化在心、脑组织缺血缺氧时起到了重要的保护作用。除了经典的造血功能以外，EPO和CEPO对整个生物体稳态的维持也发挥着重要的作用。EPO作为一种促血管生成因子，直接参与创伤愈合、月经周期、炎症、肿瘤、视网膜病变等生理性和病理性新生血管形成，并且具有与血管内皮生长因子相当的效应。EPO直接或通过调节细胞周期蛋白促进内皮细胞增殖，保护内皮细胞的完整性。EPO与其受体结合可以促进新生血管形成。作为EPO的新一代高效能衍生物，CEPO对内皮细胞的作用如何是本课题研究的主要内容。 目前关于CEPO的相关研究仍然较局限于动物试验领域，在急性心肌梗死PCI术后即心肌缺血再灌注损伤病人中的应用鲜有报道，利用此类患者的血清攻击血管内皮细胞造成细胞损伤模型的研究尚不多见。因此，本实验选取人脐静脉内皮细胞做为研究对象，在体外培养中充分模拟临床病理生理过程，采用血清药理学的方法建立细胞损伤模型，从而观察CEPO的保护作用，并对其信号转导机制进行了初步探讨。 方法： 本研究以ECV340内皮细胞作为研究对象，分别给予以PCI手术后12h、24h、48h和72h的患者血清，选取对数生长期的细胞，用血清分别作用24h和48h，采用TUNEL法观察细胞凋亡率，流式细胞仪观察细胞周期，放免法测定NO含量和NOS活性，ELISA法检测IL-1、IL-6等炎症因子含量，筛选PCI术后血管内皮细胞损伤的高峰时间和细胞作用时间。后加入不同浓度的EPO（100IU/ml、50IU/ml、20IU/ml、10IU/ml、1IU/ml）和不同浓度的CEPO（100IU/ml、50IU/ml、20IU/ml、10IU/ml、1IU/ml)。采用TUNEL法观察细胞凋亡率，流式细胞仪观察细胞周期，放免法测定NO含量和NOS活性，ELISA法检测IL-1、IL-6等炎症因子含量，筛选EPO及CEPO对PCI术后患者血清致ECV304细胞损伤的保护作用最佳浓度。EPO和CEPO对ECV304细胞损伤保护作用机制的研究则以生化法检测EPO和CEPO对LDH泄漏率的影响； Westernblotting analysis检测JAK2及其磷酸化蛋白含量；免疫组化法分别检测内皮细胞中pERK、pJNK、pP38的含量。 结果： 1、与阴性对照组相比，分别用PCI术后12h、24h、48h和72h患者血清处理ECV304细胞24h和48h后，凋亡率非常显著性增加（P0.01）；G0/G1期、G2/M期细胞所占比例显著降低，S期G2/M期增加（P0.05或P0.01）。 2、与阴性对照组相比，分别用PCI术后12h、24h、48h和72h患者血清处理ECV304细胞24h和48h后，，NO含量显著降低，NOS活性显著减弱（P0.05或P0.01），IL-1和IL-6含量均非常显著增加（P0.01），以48h患者血清处理ECV304细胞24h后，效果最为显著。 3、与空白对照组相比，采用1IU/ml-100IU/ml EPO给药后，吸光度值均非常显著性增加（P0.01），其中以50IU/ml EPO效果最为显著。 4、采用I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO给药后，细胞凋亡率显著降低（P0.05或P0.01））；采用20I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO给药后，S期细胞所占比例显著降低（P0.05或P0.01），采用50U/ml CEPO给药后G2/M期降低（P0.01）。 5、采用I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO给药后，NO和NOS含量显著增加（P0.05或P0.01）），IL-1和IL-6显著降低（P0.05或P0.01）），其中以CEPO20IU/ml及EPO50IU/ml效果最为显著。 6、与模型组相比，采用50IU/ml EPO或20IU/ml CEPO给药后，LDH泄漏率非常显著性降低（P0.01）。 7、与模型组相比，JAK2和P-JAK2的表达水平明显降低。 8、与模型组相比，EPO及CEPO处理后pERK、pJNK、pP38的阳性表达水平显著降低（P0.01）。 结论： 1、用PCI术后12h、24h、48h和72h患者血清处理ECV304细胞可成功建立经PCI术后患者血清诱导的人血管内皮细胞损伤模型； 2、48h患者血清处理ECV304细胞24h后细胞凋亡最为显著，内皮损伤最为明显； 3、EPO处理ECV304细胞24h后，可促进正常细胞的增殖，以EPO50IU/ml效果最为显著；而CEPO并不促进正常内皮细胞增殖； 4、CEPO也可有效缓解PCI术后患者血清造成的细胞损伤，以CEPO20IU/ml效果最为显著； 5、CEPO可降低内皮细胞凋亡指数，显著增加NO和NOS含量，显著降低IL-1和IL-6； 6、CEPO可降低JAK2及p-JAK2表达，提示CEPO可通过调控JAK2/STAT5信号通路发挥心血管保护作用；CEPO可降低pERK、pJNK、pP38表达，提示CEPO可通过调控MAPK信号通路发挥心血管保护作用。



本文编号：1715713