利用FGF13心肌条件性基因敲除小鼠研究FGF13在心律失常中的作用及其机制

  成纤维细胞生长因子同源性因子(Fibroblast growth factor homologous factors,FHFs),包括FGF11-FGF14,是一类新发现的电压依赖性钠通道(voltage gated sodium channel,Nav通道)结合蛋白,可通过调节Nav通道的表达和功能来调节组织和细胞的兴奋性。Nav通道在可兴奋细胞的兴奋性、传导性上具有重要作用,在心脏,Nav通道异常与多种心律失常的发生密切相关。如前期的研究发现FGF14突变或FGF12/FGF14基因敲除小鼠可引起家族遗传性脊髓小脑运动失调症等神经系统疾病,我们最近的研究发现FGF13在鼠类心肌组织中也有明显的表达,且可调节心肌Nav通道的功能以及兴奋性的传导,但目前并无证据证明FHFs与心律失常的发生直接相关,与哪类心律失常相关。为回答此科学问题,本课题通过制备FGF13心肌条件性基因敲除小鼠动物模型,直接在整体动物水平检测敲除FGF13对心肌电活动的影响以及是否发生心律失常,并通过观测敲除FGF13对心肌动作电位特征以及钠电流的影响来发现其可能的细胞电生理学机制,此研究将为揭示FHFs在心律失常中的作用及其机制提供重要的实验资料。第一部分获得FGF13心肌条件性基因敲除小鼠目的:(1)获得FGF13心肌条件性基因敲除小鼠。(2)评价此基因敲除小鼠在心肌组织中FGF13基因的敲除效果。方法:(1)应用电转法,southern杂交,显微注射,移植等技术获得F1代杂合子小鼠(FGF13-flox-neomycin)。(2)利用Flp-deleter小鼠与FGF13-flox-neomycin小鼠交配获得去除neomycin筛选标记基因的FGF13-flox小鼠。(3)利用myh6-Cre小鼠与FGF13-flox小鼠交配以获得心肌表达Cre重组酶的FGF13-flox小鼠。(4)给予他莫昔芬可获得时空调控的在心肌特异性敲除FGF13的小鼠。(5)利用实时定量PCR(q PCR)技术,蛋白免疫印迹技术和细胞免疫荧光染色技术来评价FGF13心肌组织特异性敲除小鼠的敲除效果。结果:(1)利用Cre-Lox P基因打靶原理,首先制备了FGF13-flox-neomycin F1代杂合子小鼠,然后将其与Flp-deleter小鼠交配以去除neomycin标记筛选基因,最后再将得到的FGF13-flox小鼠与心肌特异性表达Cre重组酶的myh6-Cre小鼠交配获得在心肌特异性表达Cre重组酶的FGF13-flox小鼠,此时给予他莫昔芬后即获得时空调控的心肌组织特异性敲除FGF13的小鼠(myh6-FGF13)。(2)通过q PCR技术检测发现myh6-FGF13小鼠的心室肌组织中FGF13 m RNA的水平明显降低,约为野生型的5%。(3)利用蛋白免疫印迹技术发现,与对照鼠比,FGF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌组织的表达明显降低。(4)细胞免疫荧光技术发现,与对照鼠比,FGF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌细胞内的表达明显降低。结论:我们成功制备FGF13-Lox P小鼠,并经与心脏表达Cre的小鼠杂交,获得心肌条件性敲除FGF13的基因敲除小鼠,并证明FGF13基因/蛋白在小鼠心室肌中被成功敲除,提示此基因敲除小鼠可用于后续的相关研究。第二部分利用FGF13心肌条件性基因敲除小鼠研究FGF13在心律失常中的作用及其机制目的:(1)观察FGF13是否与某种心律失常的发生有关。(2)探索FGF13引起心律失常发生的机制。方法:(1)利用整体动物体表心电图技术肢体二导联的方式,记录各组小鼠的心电图,观测敲除心肌FGF13是否有心律失常发生。(2)应用电流钳技术记录小鼠心肌细胞的动作电位,观察心肌敲除FGF13后动作电位的变化。(3)利用电压钳技术检测钠通道电流密度及门控特征的变化。结果:(1)FGF13心肌条件性敲除小鼠心电图QRS间期显著延长,给予氟卡尼后可诱导出Brugada综合征特有的心电图表型。(2)FGF13心肌条件性敲除小鼠心室肌细胞的动作电位幅度明显降低,0期除极速率明显减慢,50%复极时间明显延长。(3)在FGF13心肌条件性敲除小鼠心室肌细胞钠通道电流密度显著降低,失活曲线向超极化方向移动,激活曲线无显著性改变。结论:FGF13心肌条件性敲除小鼠可出现Brugada综合症的特征性心电图表型,造成此病变的原因可能与敲除FGF13后可降低心室肌钠通道电流密度,进而使动作电位幅度和上升速率降低有关,以上提示FGF13很可能是引起某种Brugada综合征的致病基因。

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.7
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