旁分泌机制在脂肪间充质干细胞移植治疗心肌梗死中的作用

  本文关键词：旁分泌机制在脂肪间充质干细胞移植治疗心肌梗死中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

《第三军医大学》 2013年

旁分泌机制在脂肪间充质干细胞移植治疗心肌梗死中的作用

杨德忠  

【摘要】：心血管疾病是目前人类死亡的主要原因之一，目前我国人群心血管病的患病率处于持续上升阶段[1]。心肌仅有有限的自我再生能力[2]，目前的药物或介入等临床治疗方法只能延缓心力衰竭的发展[3]。干细胞移植已成为治疗心肌梗死的新策略[4]。近年来的研究证明干细胞治疗可以显著改善心室重构和提高心功能（包括左室收缩功能、舒张功能和冠脉血流储备等）[5,6]。干细胞对心肌梗死(myocardial infarction,MI)的治疗作用主要包括两个机制，即直接分化和旁分泌作用。一些研究提示间充质干细胞可以在体外诱导环境下和在体移植后分化为心肌细胞和血管细胞，实现一定程度上的心肌再生。但另一些研究认为间充质干细胞不能分化为心肌细胞和血管细胞，其治疗功能完全是旁分泌作用[7,8]——通过释放旁分泌因子到周围组织，发挥保护作用。但是，直接分化和旁分泌作用在干细胞对心肌梗死治疗中的具体机制及其各自所贡献比重尚不清楚[9,10]。 脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSC)因易大量获取、较强增殖能力和多向分化潜能，加之免疫原性低的优势，被认为是治疗心脏病的理想干细胞来源；且新鲜分离的人ADSC的数量足以达到临床治疗的细胞数量，故不需在体外扩增即可用于自体移植，，临床意义重大[11]。ADSC对心肌梗死的治疗作用明显优于骨髓来源的干细胞[8]。直接分化和旁分泌作用在ADSC治疗心肌梗死中的作用机制未见报道。最近的研究发现ADSC条件培养液(conditioned medium, CM)促进内皮细胞的存活和迁移而影响血管新生[14]。但这些研究均局限于细胞实验，ADSC-CM与ADSC是否对心肌梗死具有同等的治疗作用尚不清楚。ADSC-CM能否在动物实验中保护心肌组织和促进血管新生亦未见报道。本研究比较了ADSC-CM与ADSC对小鼠心肌梗死的治疗效果，评估了旁分泌机制在ADSC治疗中的作用，探讨了ADSC的旁分泌抗心肌细胞凋亡作用及其机制，并比较了移植后ADSC的直接分化和旁分泌作用在心肌梗死治疗作用中的贡献比重。方法： 原代分离和培养人ADSC，将经鉴定的第3～5代的ADSC用于实验。 1.用8～10周龄（20～24g）的雄性C57B/L小鼠，结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死（myocardial infarction，MI）损伤模型，实验分假手术组，MI+DMEM组、MI+ADSC-CM组和MI+ADSC组（N=12）。在MI处理的小鼠心肌梗死边缘区分别注射DMEM、ADSC-CM或者ADSC，通过观察动物生存率、TTC染色测量心肌梗死面积、超声评价心功能变化、TUNEL染色检测心肌细胞凋亡等，评价各种处理对心肌梗死的治疗效果。 2.用H2O2建立大鼠乳鼠心肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes，NRVM）体外损伤模型，观察ADSC-CM对心肌细胞的保护作用。实验分DMEM组，H2O2+DMEM组和H2O2+ADSC-CM组（N=5）。用caspase-3蛋白表达定量和TUNEL染色检测心肌细胞凋亡。结果： 1. DMEM组存活率为66.7%，ADSC-CM组存活率为70.0%，ADSC组存活率为72.7%。三个组生存率无组间统计学差异(P0.05)，提示ADSC-CM或者ADSC心肌内注射不能提高MI小鼠的存活率。 2.与DMEM组相比，ADSC和ADSC-CM心肌内注射均能减少梗死面积，但ADSC组和ADSC-CM组间无明显统计学差异(DMEM:41.9±3.0%; ADSC:32.2±2.8%; ADSC-CM:35.7±2.5%)。 3.术后4周超声结果显示，假手术组小鼠心功能前后无明显变化，DMEM组小鼠心梗后(EF:43.8±3.7%, FS:19.0±3.8%)较假手术组(EF:90.8±5.4%, FS:45.6±6.8%)明显降低。心肌内注射ADSC-CM(EF:60.4±5.8%,FS:27.6±3.5%)较DMEM明显提高心功能。ADSC组(EF:69.2±4.3%; FS:34.3±2.5%)较ADSC-CM组进一步提高心功能。 4. MI手术后4周的梗死边缘区的血管新生。ADSC组和ADSC-CM组的毛细血管密度明显高于DMEM组。但ADSC组和ADSC-CM组间无统计学差异。 5.在心肌细胞损伤模型中，H2O2诱导组caspase-3蛋白表达较DMEM组明显升高，ADSC-CM预处理可明显降低caspase-3的表达。同时TUNEL染色亦显示：ADSC-CM预处理可明显减少NRVM的TUNEL阳性率。 6. TUNEL染色检测MI后2天梗死边缘区的心肌细胞凋亡。ADSC-CM组和ADSC组的心肌细胞TUNEL阳性率较DMEM组明显减少，而ADSC-CM组和ADSC组间相比无统计学差异。 7. MI后4周，可以检测到移植存活的ADSC。ADSC不表达心肌细胞标志物Tropomyosin和a-actinin；部分ADSC可表达内皮细胞标志物vWF和平滑肌细胞标志物SMA。 8. MI后4周，ADSC-CM或ADSC均促进梗死边缘血管新生。ADSC组血管新生密度较DMEM组增加64.3%。CD31+和GFP+双阳性的细胞（ADSC直接分化的血管细胞）占新生血管总量的3.4±0.7%。直接分化在ADSC对心肌梗死治疗作用的贡献很小（小于10%），而旁分泌机制起主导作用（大于90%）。结论： ADSC-CM心肌内注射可减小心梗面积和改善心功能，起到与ADSC移植类似的治疗效果。ADSC在心肌内可分化为血管细胞参与血管新生，但直接分化对ADSC的治疗效果的贡献很小，旁分泌机制起主导作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R542.22
【目录】：

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