硫化氢拮抗低剪切应力致HUVECs自噬障碍及其机制

发布时间：2017-04-10 13:06

  本文关键词：硫化氢拮抗低剪切应力致HUVECs自噬障碍及其机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的:研究发现,自噬具有抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)作用。在As的发生发展过程中,血管内皮细胞自噬普遍存在。当血管内皮细胞自噬受抑制时,会使血管内皮细胞受损从而促As的发生和发展。在血管分叉处、弯曲血管内侧以及血管分支处,最容易发现As病灶和内皮细胞的损伤。在这些部位,血流动力学特征有很大改变,产生异常剪切应力。虽然有研究表明,高剪切应力或低剪切应力都能促进As的形成。但高剪切应力的病变条件已经远超正常生理水平,因此众多学者更倾向于低剪切应力是更主要的病变因素。又有研究表明,低剪切应力会抑止血管内皮细胞的自噬作用。硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)是近年来被发现的第三个内源性气体信号分子,它具有多种生物学效应,包括抗内皮细胞凋亡、促血管生成、抗氧化以及抗As作用等。有研究表明,H_2S能够通过AMPK途径诱导保护性自噬,抑制癌变结肠上皮细胞的增殖。因此,本研究拟以AMPK为切入点,通过建立低剪切应力诱导的HUVECs自噬障碍模型,探讨H_2S抑制低剪切应力诱导的HUVECs自噬障碍的新机制。方法与结果:1、结扎小鼠左侧颈总动脉,保留较细的甲状腺动脉血液通路,得到血流减慢,但并未停滞的低剪切应力血流模型,未结扎的对侧为正常剪切应力血流模型,采用免疫荧光染色法检测H_2S合酶胱硫醚γ裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)的蛋白表达情况。细胞实验则分别采用正常剪切应力(15dyne/cm~2)以及低剪切应力(5dyne/cm~2)处理HUVECs 1小时后,用Western blot法检测CSE的蛋白表达情况。结果显示,与正常处理组相比,低剪切应力组中CSE蛋白表达水平明显降低。这说明在低剪切应力作用下CSE表达被抑制,导致H_2S生成减少。2、分别采用正常剪切应力(15dyne/cm~2)以及低剪切应力(5dyne/cm~2)处理HUVECs 1小时后,用Western blot法检测自噬标志物LC3、Beclin1、P62的蛋白表达水平。结果显示低剪切应力组LC3、Beclin 1明显降低,自噬障碍标志物P62明显升高。这说明在低剪切应力下,HUVECs的自噬受到抑制,并发生了自噬障碍。3、不同浓度(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)Na HS预处理HUVECs30min后,再采用低剪切应力处理HUVECs1h,Western blot结果显示,与0μmol/L组相比,H_2S可拮抗低剪切应力处理后导致的细胞自噬障碍。并且这种拮抗作用呈浓度依赖性。4、将细胞随机分为3组:正常剪切应力(15dyne/cm~2)组,低剪切应力(5dyne/cm~2)组,5mmol/L PPG+低剪切应力组。其中PPG预处理细胞30min,再采用剪切应力处理HUVECs 1h。结果表明,与低剪切应力5dyne/cm~2组相比,PPG组细胞自噬减少。减少内源性H_2S的生成加重低剪切应力致HUVECs自噬减弱。5、将细胞随机分为4组:正常剪切应力(15dyne/cm~2)组,低剪切应力(5dyne/cm~2)组,100μmol/L Na HS+5dyne/cm~2组,5mmol/L PPG+5dyne/cm~2组。预处理细胞30min后再采用剪切应力处理1h。结果显示,与正常组相比,5dyne/cm~2组与PPG+5dyne/cm~2组p-AMPK/AMPK水平下降,m TOR表达升高,Na HS+5dyne/cm~2组无明显变化,表明补充外源性H_2S可拮抗低剪切应力致AMPK失活。6、将细胞随机分为5组,正常剪切应力(15dyne/cm~2)组,低剪切应力(5dyne/cm~2)组,100μmol/L Na HS+5dyne/cm~2组,AMPK抑制剂Compound C+5dyne/cm~2组,Compound C+100μmol/L Na HS+5dyne/cm~2组。预处理细胞30min后再采用剪切应力处理1h。结果显示,与5dyne/cm~2组相比,Na HS+5dyne/cm~2组p-AMPK/AMPK及LC3表达增高而m TOR表达降低,Compound C+5dyne/cm~2组LC3表达降低而m TOR表达升高;与Na HS+5dyne/cm~2组比较,Compound C+Na HS+5dyne/cm~2组p-AMPK/AMPK、LC3水平降低,m TOR水平升高。表明AMPK被抑制后,硫化氢拮抗低剪切应力致自噬障碍作用被逆转。结论:低剪切应力可致HUVECs自噬障碍,H_2S能拮抗低剪切应力致HUVECs自噬障碍。其机制与活化AMPK、降低细胞内m TOR水平,增加下游通路的自噬相关蛋白表达有关。
【关键词】：硫化氢 自噬障碍 低剪切应力 AMPK
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-18
• 第2章 实验材料与方法18-30
• 2.1 实验材料与仪器18-21
• 2.2 实验方法21-30
• 第3章 实验结果30-40
• 3.1 不同剪切应力作用下颈总动脉内膜及HUVECs CSE表达和自噬的变化30-33
• 3.2 H_2S对低剪切应力致HUVECs自噬障碍的影响33-35
• 3.3 H_2S拮抗低剪切应力致HUVECs自噬障碍分子机制35-40
• 第4章 讨论40-44
• 第5章 结论44-45
• 参考文献45-51
• 综述 一氧化氮、一氧化碳、硫化氢三种气体信号分子在动脉粥样硬化发生发展中的“cross talk”51-63
• 参考文献58-63
• 硕士期间所获科研成果及奖励63-65
• 致谢65-66
• 课题资助66

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