脂联素及其受体对血管内皮细胞一氧化氮合酶活性差异调节的分子机制研究

发布时间：2017-08-16 03:22

  本文关键词：脂联素及其受体对血管内皮细胞一氧化氮合酶活性差异调节的分子机制研究

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【摘要】：目的:随着心血管疾病所导致的病死率不断增加,心血管系统疾病已经成为全球威胁人类健康的“全民公敌”。血管内皮具有内分泌和代谢功能,大量的研究证明,许多心血管疾病都有危险因子作用于血管内皮,进一步研究表明,内皮功能紊乱可由一氧化氮(NO)释放减少或破坏增多等其他原因造成,其原因可能是精氨酸(Arg)缺乏、一氧化氮合酶(NOS)生成或磷酸化异常。内皮的正常功能破坏,可使血管收缩舒张调节介质、凝血系统因子、促生长介质之间的功能紊乱,因此成为了心血管系统疾病一致的发生发展基础[1]。脂联素(Adiponectin,APN)作为一种脂肪细胞因子,研究证明脂联素具有加速脂肪酸氧化,促进糖转运及降低肝糖输出,对抗血管内皮炎症反应,改善内皮依赖性血管舒张功能等作用[2]。此外,在冠心病及其他大血管病变中发现血浆脂联素水平明显降低,这提示脂联素与心血管病变密切相关。大量的动物实验证明,APN基因敲除(APN-/-)小鼠可导致严重的血管功能失调[3],如对乙酰胆碱的反应性舒张存在严重敏感性降低、血管内膜增厚等,这些症状给予APN之后可显著改观。但是,脂联素对内皮舒张反应性调节的具体机制并不清楚;并且脂联素及其受体如何调节其下游信号通路及机制也需进一步的研究证实。与此同时,有研究表明,窖蛋白1(Caveolin-1)存在脚手架结构,可与e NOS相互作用,从而改变NO的释放,影响血管舒张功能。但是,脂联素对血管舒张功能的调节与Caveolin-1是否有关,尚无定论。为此本实验设计如下:(1)应用脂联素及其受体基因敲除小鼠模型,观察生理量脂联素对其血管舒张功能的影响,以明确生理量APN对血管内皮功能的调节作用。(2)应用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)观察脂联素如何通过脂联素受体影响内皮功能。(3)探讨脂联素对其受体后信号NO生成及内皮一氧化氮合酶(e NOS)活性影响,进而解释脂联素对血管张力影响的机理。因而,本实验的研究目的为:1、明确APN对小鼠血管内皮功能的改善效应和对NO产生的影响;2、探索APN对HUVEC中e NOS的影响,进而揭示脂联素I型和II型受体在e NOS活性调节中的作用;3、探讨Caveolin-1是否参与脂联素受体诱导e NOS磷酸化过程,从而改善主动脉内皮功能。方法:1、选用6-8周龄正常C57BL野生型小鼠(WT),Adipo R1基因敲除小鼠(AdipoR1KO),Adipo R2基因敲除小鼠(Adipo R2KO),Cav-1基因敲除小鼠(Cav-1KO),取其主动脉,以生理量脂联素(5μg/ml)孵育15 min,观测脂联素对内皮舒张功能,NO生成的影响;2、原代培养HUVEC,并将培养的HUVEC分为5组:(1)对照组;(2)脂联素组:脂联素(终浓度为0,5,10和15μg/ml)作用0,15,30和60min;(3)脂联素+Adipo R1 si RNA组:Adipo R1si RNA终浓度50n M,5μg/ml脂联素作用15min;(4)脂联素+Adipo R2 si RNA组:Adipo R2 si RNA终浓度50n M,5μg/ml脂联素作用15min;(5)脂联素+Cav-1 si RNA组:Cav-1 si RNA终浓度50n M,5μg/ml脂联素作用15min;3、Western Blot技术测定各组HUVEC中e NOS和p-e NOS的蛋白表达量;4、应用基因沉默技术分别将HUVECs中Adipo R1、Adipo R2及Cav-1基因沉默;5、提取50μl细胞上清直接上NO检测仪,以Na NO2为标准品作标准曲线,化学发光法检测总NOx含量。结果:1、生理量脂联素能增加小鼠血管的内皮依赖性舒张效应,显著改善血管内皮功能并且这种效应依赖于NO;2、脂联素处理Adipo R1基因敲除小鼠,主动脉对ACh的舒张反应显著降低,脂联素处理Adipo R2基因敲除小鼠,主动脉对ACh的舒张反应无明显影响;3、脂联素对Cav-1KO小鼠的血管舒张反应降低;4、不同浓度及时间脂联素对HUVECs一氧化氮合酶磷酸化(p-e NOS)的影响,5μg/ml脂联素干预内皮细胞,e NOS磷酸化程度在15min时表达最高,NO生成水平也最高;5、si RNA抑制Adipo R1的表达后,与Adipo R1未抑制组相比,脂联素(5μg/ml)调节内皮细胞e NOS的磷酸化水平程度明显降低,然而,Adipo R2 KD后,与Adipo R2未沉默组相比,脂联素对内皮细胞e NOS的磷酸化程度无明显变化;6、Caveolin-1 KD,显著阻断了脂联素(5μg/ml)诱导的内皮细胞e NOS的磷酸化和NO的产生。结论:1、生理量APN通过增加NO的产生从而对小鼠血管内皮功能具有改善效应;2、APN通过脂联素I型受体增加e NOS的磷酸化水平及NO的分泌,而II型受体对脂联素诱导e NOS及NO生成影响不显著。在内皮细胞,I型II型受体在对脂联素诱导的e NOS表达及活性调节中体现明显的差异性;3、Caveolin-1与脂联素I型受体相互作用共同调节e NOS磷酸化及NO的分泌,从而对血管内皮产生保护作用。
【关键词】：脂联素受体 Caveolin-1 eNOS 磷酸化 内皮功能
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 常用缩写词中英文对照表13-14
• 前言14-16
• 第一部分 脂联素对小鼠血管内皮舒张功能的调节作用及对NO生成的影响16-25
• 1 材料与方法16-20
• 1.1 实验试剂16-17
• 1.2 实验仪器17
• 1.3 实验动物17
• 1.4 实验用液配制17-18
• 1.5 小鼠胸主动脉环的制备18
• 1.6 主动脉血管内皮活性检测18-19
• 1.7 统计学方法19-20
• 2 结果20-23
• 2.1 生理量脂联素能显著提高内皮依赖性血管舒张反应并且依赖于NO20
• 2.2 脂联素受体1和 2 对小鼠血管舒张反应的影响20-22
• 2.3 脂联素对Cav-1KO小鼠的血管舒张反应降低22-23
• 3 讨论23-24
• 4 结论24-25
• 第二部分 脂联素通过脂联素受体 1/Caveolin-1 诱导eNOS磷酸化作用可改善主动脉内皮功能25-42
• 1 材料与方法25-34
• 1.1 实验试剂25-26
• 1.2 实验仪器26-27
• 1.3 实验分组27
• 1.4 实验用液配制27-28
• 1.5 细胞培养28
• 1.6 siRNA基因沉默28-29
• 1.7 BCA测定蛋白浓度29-30
• 1.8 Western Blot30-32
• 1.9 NO含量测定32-33
• 1.10 统计学方法33-34
• 2 结果34-39
• 2.1 不同浓度脂联素对HUVEC一氧化氮合酶磷酸化（p-eNOS）的影响34
• 2.2 脂联素处理HUVEC不同时间后，，eNOS磷酸化水平的变化34-35
• 2.3 脂联素对内皮细胞eNOS磷酸化的作用以及NO的产生主要是通过脂联素I型受体，而脂联素II型受体对其无显著作用35-37
• 2.4 脂联素通过脂联素I型受体对主动脉内皮功能的改善效应需要Caveolin-1 的 参与37-39
• 3 讨论39-41
• 4 结论41-42
• 参考文献42-45
• 综述45-57
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果58-59
• 个人简历59

【共引文献】

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1 臧传欣;冠心病患者血清脂联素水平及其临床意义[D];山西医科大学;2010年

本文编号：681234