桃仁蛋白源肾素和ACE双重抑制肽的制备、分离和纯化

发布时间：2017-08-19 11:31

  本文关键词：桃仁蛋白源肾素和ACE双重抑制肽的制备、分离和纯化

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【摘要】：高血压,是一种全球人类最常见的慢性病；也是引起脑血管病、心脏病、肾脏病的发生和死亡的最主要因素。治疗和预防高血压病是建设健康中国的重要课题。目前,在血压调节系统中,单独的肾素抑制剂和ACE抑制剂是治疗高血压常用的有效药物。但是,单独使用肾素抑制剂和ACE抑制剂在临床实验中存在不良反应。联合使用ACE抑制剂和肾素抑制剂在降低血压的同时,还可以减少对其它器官的损伤。食源性的降血压肽与合成的降血压抑制剂相比,温和、安全,能减少对靶器官的伤害,还兼具其它功能特性,且易于吸收。因此,越来越多的研究者倾向于从食物中获取降血压多肽。本文的研究工作主要是桃仁分离蛋白降血压肽的制备及其分离纯化。首先以桃仁分离蛋白为原料,通过不同的蛋白酶水解,以水解度(degree of hydrolysis, DH)、ACE抑制率和肾素抑制率为评价指标,分别研究了其酶解工艺,优化了酶解工艺参数；其次桃仁分离蛋白酶解物为研究对象,通过超滤、大孔吸附树脂、凝胶过滤色谱、高效液相色谱等手段分离、纯化酶解产物,为桃仁分离蛋白资源的深入开发利用提供科学依据。得到了以下结果：1)桃仁分离蛋白水解酶的选择实验。用复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及联合使用胃和胰蛋白酶,对桃仁分离蛋白进行酶解,以DH、ACE抑制率和肾素抑制率作为评价指标,结果发现,碱性蛋白酶制备的酶解物具有较高的ACE抑制率和肾素抑制率。因此,选择碱性蛋白酶作为实验用酶。2)桃仁分离蛋白酶解工艺参数的优化实验。以桃仁分离蛋白为底物,采用碱性蛋白酶水解桃仁分离蛋白制备肾素和ACE双重抑制肽。以体外ACE抑制率和肾素抑制率为评价指标,通过单因素实验对酶解温度、酶解pH值、底物质量浓度和加酶量等酶解工艺参数进行研究,并用响应面法优化酶解工艺参数。结果表明,碱性蛋白酶水解桃仁分离蛋白制备肾素和ACE双重抑制肽的最佳工艺为酶解温度50.6℃,酶解pH值8.02,加酶量3.06%。得到的酶解产物ACE抑制率为69.03%,肾素抑制率为57.61%。3)利用超滤膜和大孔吸附树脂对桃仁分离蛋白降血压肽进行分离纯化。分别选用截留分子量(MWCO) 50KDa、10 KDa、5 KDa、1 KDa的膜对桃仁分离蛋白酶解物进行超滤分离,结果发现,超滤后各组分ACE抑制率和肾素抑制率存在较大差异,其中,MWCO为1 KDa透过液组分ACE抑制率和肾素抑制率均最高。采用大孔吸附树脂对超滤后的活性组分进行脱盐处理,考察了LSA-21、D101、XDA-6、DA201-C、LX-1180、AB-8六种大孔吸附树脂对桃仁分离蛋白降血压肽的吸附洗脱效果,发现DA201-C对桃仁分离蛋白降血压肽的分离效果为最佳,其吸附率达到68.84%,解析率达到80.75%。因此,选择大孔树脂DA201-C进行后续实验。综合考察样品的上样浓度、pH、盐浓度、上样流速、乙醇洗脱剂浓度、洗脱剂流速和洗脱剂体积等因素对桃仁分离蛋白降血压肽的纯化效果的影响,最后得出其最佳分离工艺：上样浓度20 mg/mL、pH 7.0、上样流速0.5 mL/min、乙醇浓度70%、洗脱流速1.0 mL/min。在此条件下,70%乙醇洗脱液组分具有最高的ACE抑制活性和肾素抑制活性。4) Sephadex G-15凝胶色谱和半制备RP-HPLC对桃仁分离蛋白降血压肽分离、纯化和精制。经过大孔树脂脱盐纯化后的解析液再通过SephadexG-15纯化,在样品浓度150 mg/mL、洗脱流速0.8 mL/min、上样体积1 mL的条件下,得到3个组分,其中组分G2的ACE抑制活性和肾素抑制活性相对最高。将组分G2通过半制备RP-HPLC进行分离纯化,结果发现在5个组分中,组分c的ACE抑制率和肾素抑制率最高。
【关键词】：桃仁分离蛋白 血管紧张素抑制活性 肾素抑制肽 血管紧张素转换酶抑制肽
【学位授予单位】：陕西科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1;TS201.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩写对照12-13
• 1 绪论13-22
• 1.1 桃仁蛋白及其研究进展13-14
• 1.1.1 桃仁的概述13
• 1.1.2 桃仁蛋白13-14
• 1.2. 肾素-血管紧张素-醛固酮系统14-16
• 1.2.1 血管紧张素转换酶15
• 1.2.2 肾素抑制剂15-16
• 1.2.3 重抑制剂的应用16
• 1.3 生物活性多肽16-19
• 1.3.1 食物蛋白源降血压肽的研究进展17
• 1.3.2 食物蛋白源降血压肽的制备和分离纯化17-19
• 1.4 研究目的与意义19-20
• 1.5 研究内容20-22
• 2 桃仁蛋白酶解物的制备22-38
• 2.1 引言22
• 2.2 实验仪器与材料22
• 2.2.1 实验材料和试剂22
• 2.2.2 实验仪器22
• 2.3 实验方法22-27
• 2.3.1 PKPI的制备工艺流程22-24
• 2.3.2 桃仁蛋白的酶解24
• 2.3.3 水解度测定24
• 2.3.4 ACE抑制活性测定24-25
• 2.3.5 测定肾素活性方法25-26
• 2.3.6 蛋白酶的筛选26
• 2.3.7 酶解物的抗消化性研究26
• 2.3.8 酶解工艺的单因素实验26-27
• 2.3.9 响应面优化研究27
• 2.3.10 验证性实验27
• 2.4 结果与分析27-37
• 2.4.1 蛋白酶的筛选27-28
• 2.4.2 碱性蛋白酶酶解物的抗消化性研究28
• 2.4.3 单因素实验28-32
• 2.4.4 响应面分析32-36
• 2.4.5 验证性实验36-37
• 2.5 本章小结37-38
• 3 桃仁蛋白源降血压肽的初步分离38-55
• 3.1 引言38
• 3.2 实验仪器与材料38
• 3.2.1 实验材料与试剂38
• 3.2.3 实验仪器38
• 3.3 实验方法38-44
• 3.3.1 桃仁分离蛋白酶解物的制备38-39
• 3.3.2 桃仁分离蛋白Alcalase 2.4L酶解物的肽图谱测定39-40
• 3.3.3 桃仁蛋白Alcalase 2.4L酶解物的超滤分离40
• 3.3.4 大孔吸附树脂脱盐精制40-43
• 3.3.5 多肽含量的测定43
• 3.3.6 ACE抑制率的测定43
• 3.3.7 肾素抑制率的测定43
• 3.3.8 桃仁蛋白Alcalase 2.4L酶解物脱盐后的肽图谱测定43-44
• 3.4 结果与分析44-53
• 3.4.1 桃仁蛋白Alcalase 2.4L酶解物的超滤分离44-45
• 3.4.2 大孔树脂分离纯化桃仁蛋白多肽45-52
• 3.4.3 桃仁分离蛋白酶解物树脂纯化后活性52
• 3.4.4 桃仁分离蛋白酶解物原液、超滤后和树脂纯化后的肽图谱52-53
• 3.5 本章小结53-55
• 4 桃仁蛋白源降压肽的分离、纯化和精制55-65
• 4.1 引言55
• 4.2 实验仪器与材料55-56
• 4.2.1 实验材料和试剂55-56
• 4.2.2 实验仪器56
• 4.3 实验方法56-57
• 4.3.1 葡聚糖凝胶的预处理56
• 4.3.2 葡聚糖凝胶分离纯化降血压肽的实验56-57
• 4.3.3 半制备反向高效液相分离纯化降血压肽57
• 4.3.4 RP-HPLC二次分离纯化降血压肽57
• 4.3.5 ACE抑制率的测定57
• 4.3.6 肾素抑制率的测定57
• 4.4 结果与分析57-64
• 4.4.1 Sephadex G-15对桃仁分离蛋白酶解物的分离57-61
• 4.4.2 SephadexG-15色谱对桃仁分离蛋白酶解物的分离效果61-62
• 4.4.3 半制备反向高效液相分离纯化桃仁分离蛋白酶解物62-64
• 4.5 本章小结64-65
• 5 结论与创新点65-67
• 5.1 结论65-66
• 5.2 创新点66-67
• 致谢67-68
• 参考文献68-75
• 攻读学位期间发表的学术论文目录75-76

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本文编号：700478