氧化应激和EndMT参与心房纤维化致心房结构重构的实验研究

发布时间：2017-08-22 06:22

  本文关键词：氧化应激和EndMT参与心房纤维化致心房结构重构的实验研究

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【摘要】：背景及目的:心房纤颤(atrial fibrillation)在临床上较为普遍,随全社会老龄化进程逐日加剧,其发病率节节攀升,严重阻碍了人类健康的发展。究其关键点对是房颤发生和维持的分子机制研究不够透彻。目前,房颤基础研究所涉及的主要分子机制包括电重构、结构重构、自主神经功能异常以及离子通道改变等。近几年,结构重构领域得到了更多的关注,尤其是氧化应激和纤维化的相关机制。机体在正常状态下能够产生抗氧化酶如SOD、MDA等来清除多余的ROS,使体内自由基的含量处于一个稳态。氧化应激发生时,机体内过度氧化导致细胞损伤,产生过量的ROS,致肌浆网膜受损,使胞浆钙浓度升高,心房肌纤维溶解,导致结构重构,其细胞超微结构表现为心肌纤维化。无论是动物模型、临床标本还是细胞水平,均证实导致房颤治疗后复发的重要原因之一是心肌纤维化改变,而成纤维细胞是纤维化发生的主要效应器细胞,而心肌成纤维细胞来源不明确,以及多种病理条件下不同来源成纤维细胞组成的变化尚不清楚,故明确其来源,阻断心房纤维化进程是近年来房颤基础研究领域的热点科学问题。近来发现通过心内膜和微血管内皮细胞间质转化(End MT)可能是心肌中成纤维细胞的重要来源,即内皮细胞在刺激因素如压力负荷、炎症介质等作用下难以维持细胞外基质的稳定结构,向间质转变、增生为成纤维细胞的过程。且病理状态下,成纤维细胞具有更强的促纤维化能力,加快了心房肌纤维化进程,参与心脏重构的过程。本研究拟通过观察氧化应激标志物在两组患者右房组织及血清中的表达来探讨氧化应激在房颤心房重构中的作用和意义,并在患者的心房肌组织中检测α-SMA、S100A4、CD31m RNA和蛋白的表达变化来验证End MT参与心房纤维化以及其在心房重构中的作用,研究结果期望为房颤的临床干预提供新的干预靶标。第一部分:氧化应激标志物在房颤患者心房结构重构中的变化和意义研究对象:回顾性分析新桥医院心血管外科2014年2月至5月入院,经常规心脏超声检查诊断为单纯二尖瓣病变的风湿性心脏病患者44例,根据病史及术前心电图记录分为2组。持续房颤组(AF组)26例,定义为房颤发作48h以上不能自动转复,需药物等其他手段干预,持续时间≥6月,平均年龄(53.30±8.81)岁;窦性心律组(SR组)18例,定义为从未发生过房颤,平均年龄(50.37±13.03)岁。排除标准:①合并冠心病、糖尿病、肝肾功能不全、甲功亢进或甲状腺功能减低、恶性肿瘤、心肌病等;②术前6月内服用过任何类型的ACEI和ARB类药物;③三尖瓣返流中度及以上(定义为三尖瓣返流面积≥3cm2);④房颤持续时间小于6个月;⑤年龄小于18岁或大于80岁;组织标本采集:在体外循环转流开始前,切取部分右心耳组织,剪去多余的脂肪组织后置入-80℃冰箱待测;另于每组标本中随机抽取5例置于4%多聚甲醛溶液中固定24-36h,常规石蜡包埋,连续切片(6-8张,片厚5μm),用于Masson染色及免疫组化染色、免疫荧光染色。观察心房纤维化情况,以及NOX2蛋白在右房组织的表达。血液标本采集:手术前一天抽取患者静脉血3ml,于室温放置2小时待上下分层后于4°C 1000 x g离心15分钟,小心吸取上清液,仔细标记并分装于2个EP管中,于-80°冰箱中保存,取出使用时需要再次离心。Masson染色:检测心房纤维化。免疫组化和免疫荧光染色:检测两组患者心房组织内NOX2蛋白的表达变化。ELISA法:对右心耳组织及血清中氧化应激水平进行测定。第二部分:End MT参与心房纤维化在风湿性心脏病合并AF患者心房结构重构中的意义研究对象:选取2014年7月份至10月份,在新桥医院心外科入院的42例接受单纯二尖瓣置换术的风湿性心脏病患者,纳入和排除标准同第一部分,根据病史和术前24小时心电图记录分为2组:慢性房颤组(AF组)22例,窦性心律组(SR组)20例,分组标准同第一部分。术前行心脏多功能彩超测定各心腔大小及评价心功能。标本采集:在开胸手术体外循环转流前,切取右心耳组织约200mg,剪去多余的脂肪组织后,将同一标本分成三部分;一部分用4%多聚甲醛溶液固定24-36h后常规石蜡包埋,连续切片5-6张(片厚约6um);一部分迅速置入-80°C冰箱,以备提取组织总RNA和蛋白;一部分用OCT剂包埋,置入-80°C冰箱,或立即行冰冻切片,用于免疫荧光双标染色。研究方法:Masson及Sirius-Red:观察两组患者心房纤维化程度。RT-q PCR:检测两组患者心房组织中α-SMA、CD31、S100A4 m RNA含量变化。Western blot:检测两组患者心房组织中α-SMA、S100A4蛋白的差异性表达。免疫组化、免疫荧光双标染色:检测两组标本中α-SMA、CD31、S100A4蛋白表达差异的情况。研究结果:1.第一部分氧化应激和心房重构的相关结果:(1)基线特征比较:AF组:男性7/26例,女性19/26例,SR组:6/18例,女性12/18例,AF组患者左房内径(LADd)明显大于SR组[(55.57+10.76)vs(43.94+6.21),P0.05],差异有统计学意义;AF组左室射血分数(LVEF)显著低于SR组[(63.12+7.66)vs(67.83+4.62),P0.05],AF组左房血栓和脑梗的发生率明显高于SR组[11%vs 6%;2%vs 0%,P0.05]。(2)两组患者的免疫组化结果:AF组NOX2阳性细胞面积area明显高于SR组[(32005.72+8885.11)vs(6438.32+2849.63),P0.05],AF组积分光密度值高于SR组[(4705559+1225040)vs(1213255+421952),P0.05],相比有统计学差异(3)两组患者ELISA结果:AF组右心耳组织内ROS[(18.53+3.47)vs f(13.65+3.69),P0.01],SOD[(13.32+1.25)vs(10.65+1.15),P0.05]、MDA[(15.41+1.69)vs(11.46+1.83),P0.01]AOPP[(29.69+2.09)vs(21.94+1.94),P0.01]的表达明显高于SR组。AF组血清中ROS含量[(34.6+2.61)vs(17.8+1.03),P0.05]明显高于SR组,AOPP含量[(13.64+2.56)vs(13.27+3.38),P0.05]与SR组相比差异无统计学意义。2.第二部分End MT参与房颤心房结构重构的相关结果(1)心肌间质纤维化的观察:masson染色和苦味酸天狼星红染色发现:AF组与SR组相比,右房组织胶原纤维增生明显,特别是I型胶原纤维,CVF显著增高(P0.05);(2)免疫荧光双标染色:通过激光共聚焦技术检测AF组患者可见心肌间质微血管内皮有S100A4、CD31两种蛋白荧光强阳性表达,而SR组只有CD31表达,S100A4蛋白表达较弱或没有表达。(3)免疫组化染色:两组患者右房心肌组织中均有S100A4、α-SMA、Vi蛋白表达,AF组呈强阳性表达,SR表达较弱。(4)实时荧光定量PCR检测:AF组患者右心房组织中S100A4、α-SMA m RNA表达均显著高于SR组(P0.05),而AF组心房组织中CD31m RNA表达低于SR组(P0.05);(5)免疫印迹实验检测:AF组患者右心房组织中S100A4、α-SMA蛋白表达显著高于SR组(P0.05);结论:1.房颤时左房内径增大更明显,射血分数减低,左房血栓及脑栓塞发生率明显增高,而且发生了以心房纤维化为主的结构重构。2.氧化应激分子标志物表达升高,以心房组织显著,表明氧化应激和心房纤维化密切相关,提示可能存在NADPH氧化酶/NOX2↑一体内氧化应激/炎症介质增加一纤维化改变-结构重构一房颤易感性增强这一链式反应。3.End MT参与了心房结构重构,心房肌组织中内皮细胞可转为化成纤维细胞参与心房纤维化,表现为成纤维细胞特异性标志物α-SMA和FSP-1(又称S100A4)、vimentin m RNA和蛋白表达在右房组织中显著升高,而内皮细胞标志物CD31 m RNA和蛋白表达在右房组织中明显降低。
【关键词】：心房颤动 结构重构 心房纤维化 氧化应激 End MT
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.75
【目录】：

• 英文缩写一览表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 第二章 氧化应激标志物在房颤患者心房结构重构中的变化及意义18-28
• 2.1 材料与方法18-22
• 2.2 结果22-26
• 2.3 讨论26-27
• 2.4 结论27-28
• 第三章 End MT参与心房纤维化在瓣膜合并房颤患者心房结构重构中的意义28-46
• 3.1 材料和方法28-36
• 3.2 结果36-44
• 3.3 讨论44-45
• 3.4 结论45-46
• 全文结论46-47
• 参考文献47-50
• 文献综述 心房结构重构作用机制的研究进展50-58
• 参考文献54-58
• 研究生在读期间发表论文情况58-59
• 致谢59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 范文茂;徐新;袁书国;张社兵;唐良秋;姜月平;陈勇;;MicroRNA-223及MMP-9在风湿性心瓣膜病合并心房颤动患者中的表达及临床意义[J];岭南心血管病杂志;2014年02期

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本文编号：717538