MicroRNAs在老年性窦房结功能减退中的作用及机制研究

发布时间：2017-08-22 15:38

  本文关键词：MicroRNAs在老年性窦房结功能减退中的作用及机制研究

  更多相关文章： 老年 窦房结 microRNA 离子通道蛋白

【摘要】：一、背景与目的老年窦房结功能减退病人数量逐年增加,给社会造成极大负担,但是目前诊断这种疾病的检查方法有限,不能做到早期诊断,给治疗带来很大不便。近些年来关于疾病生物标志物的研究快速发展,特别是杨宝峰等关于microRNAs在心肌梗死中作用的研究,不仅启发我们提出有关老年窦房结功减退疾病生物诊断标志物的研究方向,并给我们的研究提供了方法参考。1.microRNAsmicroRNAs是长度为20-25nt的单链非编码RNAs,其发挥生物功能主要方式：与mRNAs互补或者非互补方式结合降低mRNAs稳定性,使靶基因的表达下调;与mRNAs结合,阻断蛋白翻译过程,使靶基因表达降低。最新的研究证明,nicroRNAs除了在近几年来的研究证明,microRNAs在组织器官分化发育与疾病的病理生理过程中发挥重要作用。此外,对其在临床疾病诊疗中的应用研究表明,microRNAs可作为疾病的生物诊断标志物,如今在心肌损害、肿瘤以及肝功能监测中已经得到广泛关注与应用。2.老年窦房结功能减退窦房结位于界嵴附近,是心脏跳动的起搏中心。随着年龄增长,窦房结及其周围组织逐渐纤维化,窦房结细胞和各种过渡细胞发生凋亡而减少。同时窦房结细胞起搏相关离子通道蛋白基因表达变化,起搏电流谱改变。可能在这两种机制的共同作用下,窦房结起搏功能逐渐减退,具体表现为固有心率的下降和窦房结传导时间的延长。由于窦房结功能减退与心血管严重程度和死亡率明显相关而日益受到人们的重视。3.起搏相关基因起搏相关基因是一些影响窦房结细胞四期自动除极的离子通道蛋白基因,以及影响窦房结内信号传导的缝隙连接蛋白基因。研究发现,主要有超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因、L型钙通道基因、钾离子通道基因与缝隙连接蛋白基因。随年龄增长,这些窦房结内基因的表达可发生重塑,导致固有心率下降。已经通过动物实验证明。近来的研究证明,microRNAs与细胞凋亡、炎症、离子通道的重塑可能存在密切关系。为了寻找老年窦房结功能减退的疾病生物诊断标志物并阐明其发病机制,我们通过探索老年窦房结功能异常的病人血液中是否存在microRNAs异常表达,通过表达谱芯片及荧光定量PCR验证,从中挑选出三个我们认为差异性明显的microRNAs, microRNA-103、microRNA-107、microRNA-1976。然后验证这些小分子物质是否通过调控靶基因的表达变化,影响心脏功能,为疾病的临床诊断和治疗提供理论依据。二、方法1.老年窦房结功能减退患者血清microRNAs表达谱差异及靶基因预测收集老年窦房结功能减退患者与健康老人的血液。对血样进行表达谱芯片分析,挑选差异性表达明显的microRNAs。通过Miranda, mirbase, targetscan预测靶基因。2.荧光素酶报告系统证实老年窦房结功能减退患者异常升高的microRNAs靶向作用于窦房结起搏相关基因构建microRNA表达质粒,Luc-UTR报告基因,将质粒瞬转293T细胞。通过检测luciferase活性,分析microRNA组与空白组荧光素酶活性的差异,判断microRNA是否对目的基因3'UTR有作用,明确microRNA是否靶向作用于窦房结起搏相关靶基因。3.异常升高的microRNAs对人ips源性窦房结细胞中起搏相关离子通道蛋白CACNA1C、CACNA1D、CACNA1I、KCNQ1和KCNH2表达水平的影响通过标记HCN4的免疫荧光实验,分析窦房结细胞百分比。通过显微摄像技术留下质粒瞬转前后照片与视频资料,统计分析心肌细胞瞬转前后跳动节律变化,从功能上验证microRNAs影响窦房结功能。收集细胞,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(realtime PCR)技术和western blot方法,测定人ips源性窦房结细胞,瞬转前后,钙通道和钾通道各：mRNA和蛋白表达水平变化,证明microRNAs通过调控起搏相关基因影响窦房结功能。三、结果1.老年窦房结功能减退患者血表达谱芯片分析与靶基因预测结果老年窦房结功能减退患者与健康老人血中,明显差异性表达的microRNAs为microRN A-103、microRNA-107、microRNA-1976。通过靶基因预测软件Miranda, mirbase, targetscan得到microRNA-103、microRNA-107的靶基因为KCNQ1和KCNH2, microRNA-1976的靶基因为CACNA1C、CACNAID. CACNA1I。2.老年窦房结功能减退异常升高的microRNAs的作用靶点通过显著性检验(一般P0.05)确定存在结合位点(一般归一化0.85)。Firefly结果与Renilla结果对比值：1976+ CACNA1I-U1为0.836885,1976+ CACNA1D-U1为0.903125,1976-CACNA1C-U1为0.740264,103a+KCNQ1-U1为0.693293,103a+KCNH2-U1为0.746934,107+KCNQ1-U1为0.820935, 107+KCNH2-U1为0.653819。3.人ips源性窦房结细胞株中窦房结细胞百分比经统计分析,发现被标记细胞占细胞总量的10%-15%左右。4.人ips源性窦房结细胞microRNAs导入前后细胞跳动频率变化将瞬转后,培养72h的microRNAs组与对照质粒组进行统计分析,在柱状图中可以清楚的看到两者间存在显著差异,瞬转microRNA-103组的跳动频率较对照质粒组减慢。瞬转microRNA-107组的跳动频率较对照质粒组减慢。瞬转microRNA-1976组的跳动频率较对照质粒组约减慢。5.人ips源性窦房结细胞microRNAs导入前后钙通道与钾通道表达变化通过实时荧光定量PCR技术,得到microRNAs的靶基因mRNA的表达水平的变化,microRNA-103、microRNA-107的靶基因mRNA (KCNH2、KCNQ1)均表达水平升高,而microRNA-1976使靶基因CACNA1C、CACNA1D的mRNA的表达水平降低,对于CACNA1I的作用不是太明显。蛋白免疫印迹的结果表明,microRNA-103、microRNA-107使KCNH2、KCNQ1的蛋白上调表达,microRNA-1976使CACNA1C、CACNA1D与CACNA1I编码的蛋白下调表达,其结果与RTPCR的结果一致。四、结论：1.通过我们的研究发现了老年窦房结功能减退患者血中差异性表达的microRNAs, microRNA-103、microRNA-107、microRNA-1976,提示其有望应用于疾病的诊断。2.验证了差异性表达的microRNAs在起搏相关基因存在作用靶点。3.验证microRNA-103、microRNA-107使人窦房结细胞中的KCNH2、 KCNQ1表达上调,调节窦房结跳动节律的变化,而microRNA-1976通过下调钙离子通道蛋白表达,调控窦房结的跳动节律。从细胞水平上验证了microRNAs调控离子通道蛋白的表达变化,是老年窦房结电生理重塑导致功能减退的分子基础。
【关键词】：老年 窦房结 microRNA 离子通道蛋白
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.7
【目录】：

• 摘要6-10
• Abstract10-21
• 缩略词21-23
• 第一部分 microRNA分子生物学特性及窦房结细胞电生理23-41
• 1.1 microRNAs概述23-30
• 1.1.1 microRNA生化23-24
• 1.1.2 microRNAs组织分布特异性24-27
• 1.1.3 microRNAs与心脏疾病27-30
• 1.2 心脏传导系统30-38
• 1.2.1 心脏解剖基础30-31
• 1.2.2 心脏传导系统31-32
• 1.2.3 心肌细胞电生理32-37
• 1.2.4 窦房结的解剖与功能37-38
• 1.3 小结38-41
• 第二部分 老年窦房结功能减退患者血浆microRNAs表达谱差异及靶基因预测41-45
• 2.1 前言41
• 2.2 材料和方法41-42
• 2.3 结果42-45
• 第三部分 荧光素酶报告系统证实老年窦房结功能减退患者异常升高的microRNAs靶向作用于窦房结起搏相关基因45-49
• 3.1 前言45
• 3.2 材料和方法45-47
• 3.3 实验结果47-49
• 第四部分 异常升高的microRNAs对人ips源性窦房结细胞中起搏相关离子通道蛋白CACNA1C、CACNA1D、CACNA11、KCNQ1和KCNH2表达水平的影响49-87
• 4.1 前言49
• 4.2 材料49-55
• 4.2.1 材料来源49-50
• 4.2.2 实验试剂及主要配置方法50-54
• 4.2.3 主要仪器54-55
• 4.3 实验方法55-71
• 4.3.1 质粒提取55-57
• 4.3.2 细胞复苏及支原体检测57-60
• 4.3.3 瞬转前细胞照片、视频资料收集60
• 4.3.4 免疫荧光60-61
• 4.3.5 免疫荧光图片信息采集61
• 4.3.6 质粒瞬转61-63
• 4.3.7 瞬转后细胞照片、视频资料收集63
• 4.3.8 RNA提取63-64
• 4.3.9 RNA浓度及RNA质量测定64-65
• 4.3.10 cDNA的合成65-66
• 4.3.11 引物设计与合成由上海迅捷生物工程有限公司完成66-67
• 4.3.12 实时荧光定量PCR67-68
• 4.3.13 蛋白的免疫印迹分析68-71
• 4.4 实验结果71-87
• 4.4.1 质粒提取检测结果71-72
• 4.4.2 支原体检测结果72-73
• 4.4.3 细胞免疫荧光结果73-74
• 4.4.4 质粒瞬转心肌细胞结果74-77
• 4.4.5 质粒瞬转心肌细胞前,与质粒瞬转培养72h后,不同组别不同视野心肌细胞跳动节律变化统计77-82
• 4.4.6 RNA提取结果分析82-83
• 4.4.7 rtPCR结果分析83-85
• 4.4.8 蛋白免疫印迹结果分析85-87
• 第五部分 讨论87-93
• 第六部分 展望93-94
• 致谢94-95
• 参考文献95-108
• 硕士期间发表论文108

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 楼锦新;;测定窦房结不应期估价窦房结功能的研究[J];医学研究通讯;1985年06期

2 刘传木，，张玉琢;心内窦房结功能测定5例[J];实用儿科临床杂志;1996年06期

3 郭剑平,周玉燕;127例青年窦缓者的窦房结功能检查结果分析[J];实用心电学杂志;2002年04期

4 沈胜芝,李焕娣;治疗量慢心律致窦房结功能抑制2例[J];医师进修杂志;2003年17期

5 周圣华,宋治远,李永华;兔窦房结组织急性损伤后细胞形态结构改变的动态观察[J];第三军医大学学报;2005年07期

6 张薇;孙超峰;;窦房结功能测定在正常人群的增龄性变化[J];实用医技杂志;2007年13期

7 张薇;孙超峰;程功;;大鼠固有窦房结功能的增龄性变化[J];第四军医大学学报;2008年22期

8 张薇;孙超峰;杨海涛;;正常窦房结功能的增龄性变化[J];第四军医大学学报;2008年21期

9 伍端娴;;窦房结的超微结构及其电活动[J];广医通讯;1980年02期

10 刘忠铭,高长斌,刘德铭,张慕兰,魏大愚;正常人窦房结功能检查[J];白求恩医科大学学报;1982年05期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 周圣华;宋治远;李永华;姚青;;兔窦房结组织急性损伤后电生理功能与缝隙连接蛋白表达改变的研究[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

2 张新中;张东成;;窦性心动过缓窦房结功能检查评价[A];第二届全国心功能学术研讨会论文摘要汇编[C];1990年

3 刘燕青;彭瑞云;徐新萍;高亚兵;王水明;王惠;赵黎;;微波辐射对大鼠心脏窦房结功能影响的研究[A];第八届全国生物医学体视学学术会议、第十一届全军军事病理学学术会议、第七届全军定量病理学学术会议论文（摘要）汇编[C];2012年

4 高亚兵;刘艳青;彭瑞云;王丽峰;左红艳;董霁;张静;姚斌伟;王惠;王水明;徐新萍;;大鼠窦房结组织切片制作方法及其在微波辐射致心脏损伤研究中的应用[A];第八届全国生物医学体视学学术会议、第十一届全军军事病理学学术会议、第七届全军定量病理学学术会议论文（摘要）汇编[C];2012年

5 郑源庞;姚雪艳;龚康敏;王红裔;柴秀娟;樊良卿;;扶本增率汤对窦房结功能的影响初步观察[A];第二届全国心功能学术研讨会论文摘要汇编[C];1990年

6 宁佩萸;何振山;李洁;;三S征电生理诊断标准的商榷[A];第四届全国心功能学术研讨会论文摘要集[C];1994年

7 彭瑞云;刘燕青;高亚兵;徐新萍;赵黎;董霁;姚斌伟;张静;王水明;常公民;周红梅;苏振涛;;微波辐射致大鼠窦房结损伤效应及其机制[A];第十三届中国体视学与图像分析学术会议论文集[C];2013年

8 李朝晖;竞花兰;陈玉川;程上尤;程小冰;孙彬;;窦房结动脉血栓栓塞猝死案例分析[A];全国第六次法医学术交流会论文摘要集[C];2000年

9 汪芳;孙宝贵;冯金芝;陈岗;孟伟栋;庄文燕;薛吉祥;;冷冻消融对犬窦房结功能和电生理的影响[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

10 邹竞;佟铭;;心律失常与窦房结功能[A];第四届全国心功能学术研讨会论文摘要集[C];1994年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 冯友根;黄连素能治病态窦房结综合征[N];中国医药报;2004年

2 主任医师 杨年;老人心跳慢 警惕有疾患[N];医药养生保健报;2007年

3 卫生部北京医院心内科主任 杨杰孚　整理 吴刚;冠心病与病窦无因果关系[N];健康报;2010年

中国博士学位论文全文数据库 前8条

1 王庆捷;5-羟色胺对冠状动脉平滑肌细胞增殖、迁移和窦房结自律性的影响[D];东南大学;2016年

2 张璐萍;血管化组织工程化窦房结的构建及应用基础研究[D];第二军医大学;2013年

3 高翔;SCN5A基因突变/缺失致窦房结功能改变的研究[D];华中科技大学;2008年

4 陈卉;Caveolin-3与正常及心衰兔窦房结超极化激活环核苷酸门控通道作用的实验研究[D];武汉大学;2014年

5 王庆志;兔窦房结缺血—再灌注损伤及L-精氨酸的干预作用[D];第一军医大学;2005年

6 张倩;模拟缺血预适应对原代培养乳鼠窦房结细胞形态结构与电生理功能影响的研究[D];第三军医大学;2005年

7 周敬群;室房逆传对窦房结功能和心房肌电活动影响的实验及临床研究[D];华中科技大学;2005年

8 吴晶晶;I_（Na，L）导致SAN功能紊乱和心内传导障碍[D];华中科技大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 邵延翔;MicroRNAs在老年性窦房结功能减退中的作用及机制研究[D];昆明理工大学;2016年

2 刘帅;绵羊窦房结组织结构的图像分析[D];泰山医学院;2011年

3 周圣华;兔窦房结组织急性损伤后电生理功能与细胞形态结构改变及缝隙连接蛋白表达的研究[D];第三军医大学;2004年

4 李凤霞;绵羊窦房结外形的计算机三维重建[D];泰山医学院;2013年

5 查承沁;年龄相关的窦房结老化及其表观遗传机制的研究[D];重庆医科大学;2014年

6 段炼;成熟猪窦房结细胞生物学特性的研究及自体移植的初步探讨[D];第二军医大学;2007年

7 李永华;缺血再灌注对在体兔窦房结细胞形态结构与电生理功能影响的研究[D];第三军医大学;2002年

8 王景安;犬窦房结功能阻滞下心房高速起博诱发急性房颤电重构的实验研究[D];天津医科大学;2005年

9 张德重;缺血后处理对家兔窦房结功能及细胞凋亡的影响[D];山西医科大学;2008年

10 邓松柏;犬窦房结中HCN4和KCNE2表达的年龄相关性变化[D];重庆医科大学;2010年

本文编号：719965