新型DNA-RNA纳米载体的构建及其调控肺动脉内皮细胞生长及机制的研究
本文关键词：新型DNA-RNA纳米载体的构建及其调控肺动脉内皮细胞生长及机制的研究
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【摘要】：研究背景:肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺血管压力增高为其主要特征的一类临床综合征,是慢性阻塞性肺疾病、肺心病等临床肺部疾病的重要病理生理基础。而低氧肺动脉高压是(HPH)是PAH临床分类的主要类型之一,其主要的病理改变是低氧刺激肺血管平滑肌细胞和内膜组织的异常增生,导致血管腔的狭窄,肺血管阻力增高及肺血管的重构。研究表明,肺动脉内皮细胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAECs)的功能紊乱是该病发生及发展的关键环节,目前认为内皮功能紊乱主要包括内皮细胞凋亡抑制,增殖增加,那么为寻求HPH的治疗靶点,我们将内皮细胞在低氧条件下增殖调控的具体机制作为研究的重点,探索HPH治疗的新方法。自噬(autophagy)是细胞内自体吞噬的一个过程,在正常的生理状态下,它有利于细胞维持自身稳态,当位于应激的状况时,如低氧、饥饿条件,自噬状态的改变将影响细胞里的稳定状态,影响细胞的增殖、凋亡、周期、迁移或侵袭等。自噬是低氧下内皮细胞的一个重要调控因素,而ATG101是调控自噬的重要基因。本文旨在探索低氧对PAECs自噬的影响及其对增殖调控的具体机制。针对临床上的常见病及难治病,传统的药物治疗,往往是对症治疗,有着药物副作用大,而且会再次发作等问题,为了满足人们日益增高的治疗需求,针对DNA水平上的新型治疗方式应运而生,基因治疗(gene therapy)是往机体或细胞中导入工作基因来达到预想的治疗目的。包括:小干扰RNA、非编码RNA,mi RNA等。那么如何将si RNA高效地转运,已成为我们面临的主要难题之一。而纳米系统作为运载体已越来越受到人们重视,相对与传统的病毒类载体,纳米系统,尤其是DNA、RNA等天然的生物分子为材料的纳米载体,存在免疫原性非常低,易生物降解,低毒或无毒,结构稳定,合成简单等优点,是非病毒运载系统中最重要的一种新型运载方式。把DNA作为支架,自组装合成三角板状的纳米载体,并采用DNA-RNA杂交技术,将运载目的基因ATG101si RNA以互补配对的方式组装入DNA纳米三角板,形成新型DNA-RNA纳米运载系统。研究其在细胞内的转运情况,并探索目的基因对低氧条件下的PAECs自噬和增殖的影响,及其调控的分子机制,提供防治PAH的新理论依据和治疗方法。研究目的:自组装能够携带ATG101si RNA的DNA纳米三角板,检测其胞内转染效率,并研究纳米系统对PAECs自噬和增殖的影响。研究方法:1.制备能够携带ATG101si RNA的DNA纳米三角板(ATG101si RNA-TNP)并研究其纳米系统的特性。(1)采用水浴阶梯降温的方法制备DNA纳米三角板携带ATG101si RNA(2)采用原子力显微镜、凝胶电泳观察制备的纳米体系的超微结构及合成效率。2.携带靶蛋白si RNA的DNA纳米三角板在肺癌细胞内摄取及转染效率的检测。体外培养肺癌细胞(A549,H292),DNA纳米系统转染A549、H292后,采用激光共聚焦及流式细胞术检测肺癌细胞对DNA纳米系统摄取的时间和剂量的依赖性;应用RT-PCR及Western blot检测靶蛋白表达情况。3.携带ATG101si RNA的DNA纳米三角板对A549细胞生长的影响ATG101si RNA-TNP纳米系统转染A549细胞,电镜、激光共聚焦、WB检测细胞自噬水平的变化,MTT的方法检测活力,凋亡用流式细胞术(FCM)来检测。4.携带靶蛋白ATG101si RNA的DNA纳米三角板对PAECs生长的影响体外培养肺动脉内皮细胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAECs),ATG101si RNA-TNP纳米系统转染PAECs后,激光共聚焦观察自噬荧光表达;Western blot检测自噬及增殖标志蛋白的表达。5.携带靶蛋白ATG101si RNA的DNA纳米三角板对低氧条件PAECs生长的影响体外培养PAECs,放置于低氧孵育箱中(1%O2、5%CO2、94%N2)中,并用ATG101si RNA-TNP纳米系统转染PAECs,分别检测纳米载药系统对细胞自噬、增殖及凋亡的影响。6.ATG101是通过Hedgehog信号通路来调控低氧下PAECs的凋亡ATG101si RNA-TNP纳米系统转染PAECs后,采用Western blot检测ATG101沉默后,信号通路蛋白Hedgehog,Gli的表达研究结果:1.成功自组装构建以单链DNA作为骨架,si RNA单链为载体的DNA纳米三角板,原子力显微镜观察示:三角形的纳米结构,且分布均匀;凝胶电泳结果分析:水浴阶梯降温法自组装合成的纳米系统产率高,结构稳定。2.肿瘤细胞系的体系稳定,因此以两种肺癌的细胞作为预实验对象,结果是两种肺癌细胞(H292,A549)均能摄取DNA纳米系统,且相对于单独的si RNA,纳米材料携带的si RNA更易被细胞摄取,并且具有时间及浓度依赖性,激光共聚焦和流式细胞术结果均显示随着浓度和时间的增加,其转染效率增强;纳米系统是巨胞饮及网格蛋白介导的胞吞的路径进入细胞。纳米材料携带的si RNA能高效进入细胞并发挥其生物学效应,RT-PCR和Western blot结果显示在m RNA及蛋白水平靶蛋白的表达明显下降。3.ATG101si RNA-TNP转染入A549细胞,抑制ATG101的表达后,抑制细胞自噬,激活了凋亡,从而导致A549细胞生长抑制。4.携带靶蛋白ATG101si RNA的DNA纳米三角板能被PAECs高效摄入,并沉默靶蛋白ATG101,其效应有时间和浓度依赖性;激光共聚焦及Western blot结果均显示抑制靶蛋白后,明显抑制自噬水平,同时抑制细胞生长。5.低氧条件下,PAECs的自噬及增殖水平升高,激光共聚焦及Western blot显示沉默ATG101后,自噬水平下降,MTT结果表明细胞PAECs生长受到抑制,FCM检测发现激活了细胞凋亡。6.低氧条件下,沉默ATG101抑制细胞自噬后,是通过Hedgehog-GLi信号通路来激活PAECs的凋亡,从而抑制细胞生长。结论:1.成功自组装合成能够携带ATG101si RNA的DNA纳米三角板,合成产物产率高,结构稳定,此纳米系统可以成功且高效的转入肿瘤细胞及正常细胞中,并且发挥si RNA的生物学效应,说明此纳米体系稳定,具有广泛的应用前景。2.DNA纳米三角板携带ATG101si RNA进入A549,细胞自噬水平受到抑制,凋亡激活,最终导致细胞生长受到了抑制。3.DNA纳米三角板携带ATG101si RNA进入PAECs,能抑制低氧条件下细胞自噬水平,并通过Hedgehog-GLi信号通路诱导细胞凋亡,从而导致PAECs生长抑制,说明autophagy可以调节低氧条件PAECs增殖和凋亡的失衡。
【关键词】：肺动脉高压 DNA纳米材料 ATG101siRNA 自噬 增殖和凋亡失衡
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1
【目录】：
- 缩略语表4-5
- 英文摘要5-9
- 中文摘要9-12
- 前言12-14
- 第一章 新型DNA-RNA纳米载体的设计及组装14-21
- 1.1 实验材料与方法15-18
- 1.2 结果18-20
- 1.3 讨论20
- 1.4 小结20-21
- 第二章 自组装的DNA纳米三角板是一个安全高效的基因运载体21-53
- 2.1 自组装DNA纳米三角板的胞内安全高效摄入22-44
- 2.2 DNA纳米载体携带ATG101siRNA对肺癌细胞的影响44-53
- 第三章 新型DNA纳米载体携带ATG101siRNA对肺动脉内皮细胞生长的影响及机制的研究53-73
- 3.1 实验材料与方法54-58
- 3.2 结果58-71
- 3.3 讨论71-72
- 3.4 小结72-73
- 全文结论73-74
- 参考文献74-79
- 文献综述 内皮功能失衡与肺血管重构79-89
- 参考文献85-89
- 在读期间发表的论文89-90
- 致谢90
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，本文编号：725315
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