利用大鼠原代心肌细胞研究HZFHG5a

发布时间：2017-09-02 13:15

  本文关键词：利用大鼠原代心肌细胞研究HZFHG5a

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【摘要】：心肌肥大的发病机制一直以来是心血管疾病研究领域的研究热点之一,近年来对于心肌肥大的发生已取得很大的进展,但是其分子机制仍远未阐明。因此,研究清楚心肌肥大发生的相关分子机制对阐明心脏病的发病机理、基因诊断并最终利用分子干预手段治疗心脏病,都具有非常重要的意义。心肌肥大是心肌细胞对高血压、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心脏病等常见临床疾病的一种基本应答。本实验室前期工作已经从心脏cDNA文库中克隆得到人类新基因HZFHG5a。通过组织表达分析发现HZFHG5a主要在小鼠的肠、肾、肝、心脏中表达。免疫共沉淀结果证明了HZFHG5a能与TGF-β信号通路中的SMAD6/7发生相互作用。同时利用HZFHG5a基因过表达的稳定细胞系发现HZFHG5a能够部分抑制TGF-β信号通路中由TGF-β刺激所引起的SMAD2/3蛋白的磷酸化程度,进而抑制SMAD4蛋白的穿核过程。由此可见HZFHG5a很可能通过TGF-β信号通路参与调控心肌肥大的发生。为了进一步研究HZFHG5a调控肥大的分子机制,我们首先在HEK293A细胞系中扩增了HZFHG5a腺病毒质粒。其次分离新生大鼠心肌细胞,使用腺病毒转染心肌细胞,并利用RT-PCR和Western Blot技术检测了HZFHG5a的表达,以及经PE或10%FBS诱导后肥大标志基因ANF、β-MHC、SKA的表达。最后,我们在H9C2细胞系中转染HZFHG5a质粒过表达HZFHG5a以及荧光报告质粒,检测心脏发育相关基因的转录水平。结果表明,过表达HZFHG5a能上调肥大标志基因ANF、β-MHC、SKA的表达,提示该基因可能与心肌肥大的发生有关。
【关键词】：HZFHG5a 心肌肥大 腺病毒 新生大鼠心肌细胞
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1 引言和文献综述10-21
• 1.1 心肌肥大的研究10-11
• 1.2 心肌肥大的分类11-12
• 1.3 遗传学上对于心肌肥大和心衰的研究12-13
• 1.4 心肌肥大和心衰发生的分子机制13-14
• 1.5 TGF-β信号途径与心肌肥大的关系14-17
• 1.6 SMAD分子和心肌肥大的关系17-18
• 1.7 腺病毒的相关研究18-19
• 1.8 HZFHG5a基因的研究进展及本文研究意义19-21
• 2 材料和方法21-34
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 生物信息学软件21
• 2.1.2 菌株和质粒21-22
• 2.1.3 细胞22
• 2.1.4 器材22-23
• 2.2 方法23-34
• 2.2.1 腺病毒的扩增23-24
• 2.2.2 大鼠原代心肌细胞的分离24-25
• 2.2.3 腺病毒转染原代心肌细胞25
• 2.2.4 体外刺激心脏细胞肥大模型25-26
• 2.2.5 细胞中总RNA的提取26-27
• 2.2.6 RNA逆转录27
• 2.2.7 PCR引物设计与合成27-28
• 2.2.8 RT-PCR与琼脂糖凝胶电泳28
• 2.2.9 细胞蛋白的提取28
• 2.2.10 SDS-PAGE凝胶配制28-29
• 2.2.11 Western blot免疫印记29-30
• 2.2.12 培养细胞的免疫荧光标记方法30
• 2.2.13 无内毒素试剂盒提取质粒30-31
• 2.2.14 细胞的培养和转染31
• 2.2.15 荧光素酶报告基因活性分析实验（Luciferase）31-32
• 2.2.16 LacZ报告基因检测32
• 2.2.17 酶切产物的纯化回收32
• 2.2.18 酶切产物与载体的连接32-33
• 2.2.19 转化(热休克法)33-34
• 3 实验结果及其分析34-43
• 3.1.扩增Ad HZFHG5a腺病毒载体转染 293A细胞34-35
• 3.2 分离原代大鼠心肌细胞35-36
• 3.3 腺病毒转染新生大鼠原代心肌细胞36
• 3.4 RT-PCR分析HZFHG5a基因对于病理性肥大的影响36-38
• 3.5 Western-bolt分析HZFHG5a基因对于ANF的影响38
• 3.6 HZFHG5a过表达增大心肌细胞表面积38-39
• 3.7 HZFHG5a对SMAD4入核的影响39-40
• 3.8 HZFHG5a对ANF-luc、β-MHC-luc、CAGA-luc、NFAT-luc转录活性分析40-43
• 4 讨论43-45
• 5 结语45-46
• 参考文献46-51
• 附录一51-52
• 致谢52-53

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本文编号：778758