生长分化因子-11促进小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

发布时间：2017-09-06 18:43

  本文关键词：生长分化因子-11促进小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

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【摘要】：背景:随着社会的发展和生活水平的改善,心血管疾病已成为全球第一大死因。各种原因引起的心肌损伤均能够造成的心肌细胞的不可逆缺失,进而导致心力衰竭的发生。虽然成体的心脏中存在着一些内源性的心脏干细胞,但是由于其数量稀少,难以弥补损失的心肌细胞。随着介入医学的发展,虽然心血管疾病患者的生存质量有了明显的提高,但是目前的医疗手段仍无法实现心肌修复,恢复心功能。再生医学为其治疗带来来了新的希望。其中,诱导性多能干细胞(iPSCs)是一类来源于成体细胞的干细胞,并且具有多向分化潜能。iPSCs能够分化为心肌细胞,为心肌修复提供可靠的细胞来源,因此诱导性多能干细胞研究和应用迅速的成为热点。虽然,大量实验早已成功将iPSCs诱导分化为心肌细胞,但是定向分化效率低下,极大的阻碍了其临床应用。有研究表明生长分化因子-11(GDF-11)能够激活TGF-β信号通路,而此通路与iPSCs的心肌细胞分化密切相关。但是,关于GDF-11促进iPSCs心肌细胞定向分化的作用,尚未见有文献报道。目的:探讨gdf-11对mipscs心肌细胞定向分化的作用和分子机制,为ipscs的临床治疗提供实验依据。方法:(1)原代分离小鼠胚胎成纤维细胞(mef),制备小鼠诱导性多能干细胞(mipscs)培养所需的饲养层细胞。(2)mipscs的培养。(3)拟胚体(ebs)的制备和诱导ipscs的心肌细胞分化。(4)gdf-11浓度的优选。(5)实时荧光定量pcr检测各分化阶段性的心肌特异性基因表达变化。(6)westernblot检测心肌结构蛋白ctni表达的变化。(7)免疫荧光染色观察心肌结构蛋白ctni的表达情况。(8)westernblot检测tgf-β通路相关蛋白和线粒体功能蛋白pgc-1α的表达水平,对机制进行分析。结果:(1)光镜下mipscs复苏后第二天即可形成圆形或者椭圆形的克隆,克隆团内细胞排列紧密,细胞边界清晰。通过悬滴法诱导mipscs形成的ebs大小均一,分化至第8天可见ebs外围的细胞分化成为搏动的心肌样细胞团块。(2)通过观察不同浓度gdf-11对ctni和α-mhc表达的影响,最终确定gdf-11工作浓度为10ng/ml。(3)实时荧光定量pcr检测心肌特异性标志物的表达,结果显示:gdf-11组的oct-4表达水平较对照组显著降低(p0.01);gdf-11促进了flk-1和nkx2.5的表达(p0.01);ctnt的表达水平较对照组也有明显的升高(p0.01)。(4)两组均出现了搏动的心肌样细胞团,gdf-11组搏动ebs百分比要显著高于对照组(p0.01)。(5)westernblot显示gdf-11能够增强心肌结构蛋白ctni的表达;免疫荧光染色显示,gdf-11组的ctni阳性率要显著高于对照组(p0.01)。(6)Western blot显示GDF-11处理组的TGF-β、Smad2、以及PGC-1α均有显著的上升(P0.05)。结论:GDF-11能够提高心肌早期转录因子Nkx2.5和心肌细胞标志物cTn I的表达水平,促进miPSCs的心肌细胞分化进程,提高心肌分化效率。GDF-11的这种作用可能与TGF-β/Smad2信号通路的活化以及线粒体功能的提高相关。
【关键词】：生长分化因子-11 小鼠诱导性多能干细胞 心肌分化 TGF-β信号通路
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-26
• 1 心血管病流行病学现状15-16
• 2 心肌缺血损伤与再生修复16-21
• 3 诱导性多能干细胞21-24
• 4 生长分化因子-11（GDF-11）概述和其与干细胞分化的研究现状24-26
• 第一部分 饲养层细胞的制备以及mi PSCs的培养26-33
• 1 材料26-28
• 2 方法28-30
• 3 结果30-31
• 4 讨论31-33
• 第二部分 GDF-11 对mi PSCs心肌分化的影响33-48
• 1 材料33-36
• 2 方法36-40
• 3 结果40-44
• 4 讨论44-48
• 第三部分 GDF-11 促进mi PSCs心肌分化的机制分析48-54
• 1 材料48-49
• 2 方法49-50
• 3 结果50-51
• 4 讨论51-54
• 小结54-55
• 参考文献55-69
• 个人简历和研究成果69-70
• 致谢70

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