Survivin及其抑制剂YM155对角膜新生血管作用的研究

发布时间：2019-09-08 15:31

【摘要】：背景：由于角膜新生血管(Corneal Neo vascularization, CNV)尚无有效的治疗方法,至今仍是致盲的主要原因之一,探讨如何有效地抑制角膜新生血管的发生和发展,现已成为角膜病研究中的热点。目前对于角膜新生血管的发病机制尚未完全清楚,进一步探索角膜新生血管的发病机制及其有效治的治疗方法具有重要的理论和临床意义。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的一个重要成员,具有强大的抗细胞凋亡作用,并在维持细胞有丝分裂和血管形成过程中扮演重要角色。研究提示,survivin在多种人类肿瘤的新生血管中具有重要的作用,其是否与角膜新生血管发生有密切的关系并不清楚。目的：本研究旨在通过建立大鼠角膜新生血管模型,研究凋亡抑制蛋白survivin是否与角膜新生血管的形成相关,其特异性抑制剂YM155对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和凋亡的影响以及对角膜新生血管的作用。方法： 1.采用1mol/L NaOH诱导大鼠碱烧伤角膜新生血管模型。碱烧伤后1、3、7、14天采用带有相机的手术显微镜照相并测量角膜新生血管长度,计算角膜新生血管面积。采用免疫组织化学染色、免疫荧光染色和Western Blot检测碱烧伤后角膜组织中survivin的表达,实时荧光定量PCR检测碱烧伤后角膜组织中survivin和VEGF-A mRNA的表达。 2. HUVECs在含2%FBS和50ng/ml VEGF165的DMEM高糖培养液中培养,观察细胞的生长情况,采用免疫荧光和Western Blot检测survivin蛋白在HUVECs中的表达。MTT法检测不同浓度YM155(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160nmol/L)作用于HUVECs不同时间(12h、24h、48h、72h)后对细胞增殖的影响。流式细胞分析法检测0、5、20nmol/L YM155作用IUVECs48h后,对HUVECs凋亡的影响。Western Blot检测20nmol/L YM155作用于HUVECs不同时间(12h、24h、48h、72h)后对细胞survivin蛋白表达的影响。 3.48只健康无眼疾SD大鼠,右眼碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管形成,造模后随机分为2组,分别给予lmg/ml YM155滴眼(药物治疗组)和PBS滴眼(对照组),连续点眼14天,每日两次。手术显微镜下观察和测量各组角膜新生血管的长度和累计的钟点数,并计算出新生血管的面积。采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测两组大鼠角膜组织中survivin mRNA和survivin表达的变化。结果： 1.大鼠角膜碱烧伤后第1天,角膜缘血管扩张充血。碱烧伤后第3天可见角膜缘处毛刷状新生血管芽生长密集,并向角膜中央方向延伸。碱烧伤后第7天,新生血管生长最旺盛,血管增多变长,主干粗大笔直、末端分支相交织呈网状,部分血管吻合,延伸至角膜中央烧伤区。碱烧伤后第14天,新生血管生长接近角膜中心,几乎布满整个角膜,面积达高峰,血管伸长变细,分支减少,部分血管开始闭锁退化。免疫组织化学染色结果显示,对照组大鼠角膜组织(正常大鼠角膜)中,几乎检测不到CD31和survivin阳性染色。碱烧伤后第7天,大鼠新生血管角膜组织基质层内CD31和survivin阳性染色的棕黄色颗粒明显增多。免疫荧光结果与免疫组化结果相似,即大鼠正常角膜组织中CD31和survivin几乎没有阳性荧光染色,新生血管角膜组织基质层内,CD31和survivin阳性荧光染色明显增多,且部分染色重合。实时荧光定量PCR结果显示,正常大鼠角膜组织中少量survivin和、EGF-A mRNA表达。碱烧伤后第1天survivin mRNA升高不明显(P0.05),后逐渐升高,至碱烧伤后第3天、第7天和第14天大鼠角膜组织中survivin mRNA表达明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)；其中第7天survivin mRNA表达最高。碱烧伤后第1天,角膜组织中VEGF-A mRNA表达较正常对照组升高,差异具有统计学意义(P0.05；碱烧伤后第3天、第7天和第14天大鼠角膜组织中VEGF-A mRNA表达明显升高,差异具有显著的统计学意义(P0.01)；其中第7天VEGF-A mRNA表达最高。碱烧伤后大鼠角膜组织中survivin和VEGF-A mRNA的表达具有显著的相关性(r=0.980,P0.01)。Western Blot结果进一步证实了碱烧伤后第3天、第7天和第14天survivin蛋白表达明显升高,差异有显著的统计学意义(P0.01),其中第7天survivin蛋白表达升高至最高峰。 2.HUVECs在含2%FBS和50ng/ml VEGF165的DMEM高糖培养液中增殖明显,激光共聚焦显微镜下见HUVECs的胞浆和胞核中有survivin红色阳性荧光染色,且胞浆染色较胞核更显著。Western Blot结果显示HUVECs在此培养液中培养,survivin蛋白表达逐渐增高,至12h-18h左右达高峰,24h有所降低。MTT结果显示YM155作用HUVECs48和72h后,对细胞的体外增殖能力的抑制作用明显。药物浓度低至5nmol/L即可以显著抑制HUVECs增殖。YM155对HUVECs的抑制作用具有时间剂量依赖性。由MTT结果计算出YM155作用HUVECs48h,该药物的IC50值为8.68nmol/L;药物作用]HUVECs72h的IC50值为5.77nmol/L.流式细胞分析结果显示5和20nmol/L YM155作用细胞48小时后,与对照组相比,HUVECs凋亡明显增多,差异具有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果显示20nmol/L YM155作用HUVECs12h、24h、48h和72h, survivin蛋白表达明显减少,差异具有显著的统计学意义(P0.01)。 3.碱烧伤后第7天和第14天,YM155治疗组大鼠角膜新生血管面积明显小于对照组,差异具有显著统计学意义(P0.01)；与对照组相比,实时荧光定量PCR结果显示用药后第7天,YM155治疗组大鼠新生血管角膜组织中survivin mRNA表达明显减少,差异具有显著统计学意义(P0.01),用药后第14天,survivin mRNA表达仍小于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果进一步证实了YM155治疗组大鼠角膜组织中survivin蛋白表达明显减少,差异具有显著统计学意义(P0.01)。结论：本研究首次探讨了凋亡抑制蛋白survivin与角膜新生血管的关系。实验发现：survivin与大鼠碱烧伤角膜新生血管的形成密切相关,其抑制剂YM155对HUVECs具有明显的抑制增殖和促进凋亡作用,并且可有效抑制大鼠碱烧伤后角膜新生血管的形成,为以survivin作为靶点治疗角膜新生血管提供了理论依据和实验基础。
【图文】：

面积图,碱烧伤,新生血管,点角

华中科技大学博士学位论文图1-1.碱烧伤法诱导大鼠角膜新生血管。A,大鼠的正常角膜透明，无血管。B，，碱烧伤后第1天，大鼠角膜混油明显，角膜缘血管网扩张充血，但无明显的新生血管侵入角膜。C，碱烧伤后第3天，可见毛刷样的新生血管自角膜缘处向角膜中央方向张入。D，碱烧伤后第7天，新生血管增粗变长，到达中央的碱烧伤区。E,碱烧伤后第14天，新生血管延长到角膜中央区，儿乎覆盖整个角膜。表1-2.碱烧伤后不同时期角膜新生血管面积Id 3d 7d 14d面积（_2) 1.33±0.57 13.61±2.23 30.94±1.72 37.27±0.60

基质层,角膜基质层,碱烧伤,角膜细胞

图1-3.大鼠角膜HE染色图片。A，正常大鼠角膜HE染色，可见角膜组织结构清晰，基质层由规则排列的胶原纤维板及散在均6J分布的角膜细胞构成；碱烧伤后第7天，新生血管角膜基质层明显增厚，基质层内可见大量的血管内皮细胞以及充盈有红细胞的血管腔。Bai=20pm。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R772.2

【参考文献】