醛糖还原酶基因缺失诱导视神经损伤后巨噬细胞向M2方向极化并促进视神经功能恢复

发布时间：2017-03-21 07:01

  本文关键词：醛糖还原酶基因缺失诱导视神经损伤后巨噬细胞向M2方向极化并促进视神经功能恢复，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：哺乳动物周围神经（peripheral nervous system, PNS)有较强的再生能力，而中枢神经（central nervous system, CNS)损伤后几乎不能再生[1,2]，同样，属于中枢神经的视神经受损伤后不能再生并造成视网膜节细胞的不可逆损伤，导致视力丧失。醛糖还原酶（aldose reductase, AR）属于醛酮还原酶超家族，是葡萄糖多元醇通路中重要的限速酶[3]，最近的一系列研究显示AR在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应过程中具有重要的调节作用[4,5]，在神经再生领域上目前比较关注巨噬细胞，巨噬细胞可以极化为M1和M2两种细胞亚群，，M2细胞可以移除一些抑制轴突生长的物质如髓鞘相关蛋白从而促进视神经再生[6-8]。本课题组前期研究，在小鼠脊髓损伤模型中（Spinal Cord Injury, SCI），AR基因敲除后可以减少脊髓损伤面积并促进运动功能的恢复。本实验以AR为重点研究对象，旨在观察小鼠视神经夹伤（optic nervecrush, ONC）后醛糖还原酶（AR）对视神经损伤后功能恢复的影响及可能机制。本实验有二部分组成： 实验一建立ONC模型并观察ONC后AR在视神经的表达情况。建立视神经夹伤模型（ONC），野生型小鼠（C57BL/6-AR+/+）分两组，一组为假手术组，假手术组仅暴露视神经，一组为夹伤组模型，时间点为0d、3d、5d、7d、14d,利用westernblot、QPCR检测假手术组和夹伤组的AR蛋白表达变化情况。建立野生型小鼠和AR基因敲除型小鼠的视神经夹伤模型，选取术前4天行视觉电生理F-VEP检查并为对照组，ONC后选3d、7d和14d三个时间点行F-VEP检查，旨在观察每组夹伤前后视神经传导功能，鉴定ONC模型可靠性，并比较两组小鼠相同时间点的视神经传导功能。 实验二观察ONC后，AR对视神经再生和视网膜节细胞存活影响及可能的分子机制。首先应用野生型小鼠与YFP小鼠交配获得的AR+/+-Thy1-YFP小鼠，同样方法用AR敲除小鼠（AR-/-）和YFP小鼠交配获得AR-/--Thy1-YFP小鼠，建立视神经夹伤模型，夹伤后选取3d、7d、14d三个时间点和假手术组（CON）的眼球，冰冻切片利用荧光显微镜观察并计数假手术组和3d、7d、14d存活的视网膜节细胞数目，并比较同一个时间点两组小鼠存活的视网膜节细胞数目。为了检验两种小鼠视神经的再生情况，小鼠玻璃体内注射绿色荧光标记的霍乱毒素B（Cholera Toxinsubunit, CTB），可以顺行标记再生的视神经纤维，ONC后，处死前4天注射CTB，7d取材，冰冻切片后可直接在荧光显微镜下观察再生的神经纤维[9]。ONC后，7d收集夹伤的视神经，利用免疫荧光组织化学观察活化的巨噬细胞。ONC后，利用western blot法检测iNOS（M1标志性分子）和Arg1（M2标志性分子）的表达变化,观察野生型小鼠和AR敲除小鼠0d、3d、5d、7d、14d, iNOS和Arg1的表达变化。 第一部分实验结果， western blot法检测假手术组和ONC组0d、3d、5d、7d、14d视神经上AR的表达变化，结果显示：假手术组AR表达几乎无变化，ONC后随着时间延长AR表达增高，且第5天达到高峰，QPCR与上述趋势基本一致。ONC后两种小鼠F-VEP P1峰时值随时间延长而延长，在第3d、7d、14d时AR敲除小鼠P1峰时值明显短于野生型小鼠，在ONC后第3d、7d、14d，F-VEP P1波幅明显低于术前水平，且在第7d、14d时AR-/-小鼠波幅明显高于野生型小鼠，说明ONC模型可靠； 在第二部分实验我们发现，与对照组（假手术组）相比，ONC后第3d、7d、14d，AR+/+-Thy1-YFP小鼠和AR-/--Thy1-YFP小鼠视网膜神经节细胞数量明显下降，AR-/--Thy1-YFP小鼠存活的视网膜神经节细胞明显多于AR+/+-Thy1-YFP小鼠；ONC后第7天野生型小鼠夹伤区域及远侧端没有发现明显的再生神经纤维，AR敲除小鼠ONC区域及远侧端则发现较多的绿色荧光标记纤维，提示有明显的神经纤维再生。为了探讨AR对巨噬细胞极化的影响，AR敲除小鼠ONC后第7天Iba-1染色后可见活化的巨噬细胞；ONC后0d、3d、5d、7d、14d，Western blot法检测iNOS（M1标志性分子）和Arg1（M2标志性分子）显示：在各时间点Arg1/iNOS的比值AR敲除小鼠明显大于野生型小鼠。 以上实验我们发现：野生型小鼠ONC后AR表达量随时间延长而增加，提示AR参与了损伤过程。ONC后，AR敲除小鼠F-VEP P1峰时值明显短于野生型小鼠，而波幅明显高于野生型小鼠，说明其视神经髓鞘功能优于野生型小鼠，提示AR基因敲除可促进小鼠ONC后视神经的传导功能；同时，ONC后，AR敲除小鼠存活的视网膜神经节细胞数量及视神经纤维的长度都明显多于野生型小鼠，提示AR基因敲除不仅可以促进神经节细胞存活还可促进视神经轴突生长。ONC后，各时间点在Arg1/iNOS的比值上AR敲除小鼠明显大于野生型小鼠，提示AR可能通过促进巨噬细胞向M2极化调节炎症反应，进而促进视神经损伤后的功能恢复。
【关键词】：醛糖还原酶 视神经夹伤 视神经 M2型巨噬细胞
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R774.6
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-24
• 1. 视神经损伤后的病理变化15-18
• 2. 小胶质/巨噬细胞介导视神经损伤后的炎症反应18
• 3. 视神经损伤后的炎症反应和轴突再生18-20
• 4. AR基因的作用及在眼科方面的研究20-24
• 实验一 建立视神经夹伤模型并观察 AR 在 ONC 后视神经上的表达变化24-35
• 引言24-25
• 1 材料25-26
• 1.1 实验动物25
• 1.2 实验试剂25
• 1.3 实验仪器25-26
• 1.4 实验抗体26
• 2 方法26-30
• 2.1 小鼠 ONC 模型制备26
• 2.2 western blot 实验26-28
• 2.3 QPCR 实验28-29
• 2.4 小鼠闪光视觉诱发电位（F-VEP）检测29-30
• 2.5 SPSS16.0 处理分析数据30
• 3 实验结果30-33
• 3.1 ONC 后情况30
• 3.2 AR 蛋白表达变化30-31
• 3.3 AR 基因 QPCR 结果31-32
• 3.4 视觉电生理 F-VEP32-33
• 4 讨论33-35
• 实验二 AR 敲除促进视神经再生及可能机制35-44
• 引言35-36
• 1 材料36-37
• 1.1 实验动物36
• 1.2 主要试剂36
• 1.3 主要仪器36
• 1.4 实验抗体36-37
• 2 实验方法37-39
• 2.1 小鼠 ONC 模型（同实验一）37
• 2.2 小鼠视神经灌注、取材（组织准备）37
• 2.3 获取 AR-/-YFP 小鼠37-38
• 2.4 CTB 追踪再生神经纤维38
• 2.5 免疫荧光组织化学染色38-39
• 2.6 western Blot(同实验一)39
• 2.7 统计学分析（同实验一）39
• 3 结果39-42
• 3.1 AR 基因敲除后对视网膜节细胞存活的影响39-40
• 3.2 AR 基因敲除对 ONC 后视神经纤维再生的影响40-41
• 3.3 AR 基因敲除对 ONC 后巨噬细胞极化的影响41-42
• 4 讨论42-44
• 小结44-45
• 参考文献45-53
• 个人简历和研究成果53-54
• 致谢54

【共引文献】

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1 吴军;王爱桃;闵U

本文编号：259191