机械牵拉与PGE_2联合作用对圆锥角膜成纤维细胞LOXs家族表达的影响

发布时间：2017-04-11 06:03

  本文关键词：机械牵拉与PGE_2联合作用对圆锥角膜成纤维细胞LOXs家族表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：圆锥角膜表现为角膜渐进性中央变薄突出并扩张,呈圆锥状。临床表现为高度近视及不规则散光以及不同程度的视力下降,严重时可导致失明。圆锥角膜的形成和发展与遗传、环境等多种因素有关,但其致病机制目前尚不明确。角膜基质层是角膜的主要组成部分,决定了角膜所需的绝大部分屈光力与透光度,角膜基质层的合成与降解,与圆锥角膜的发生与发展有关。近年来一些研究表明炎性因子与机械牵拉可能是圆锥角膜致病原因之一。在圆锥角膜中,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)等炎性因子的表达高于正常角膜的表达量。长时间非正常揉眼会使泪液中的炎性因子进一步增加,加剧圆锥角膜的发展。赖氨酸氧化酶(LOXs)是一种铜依赖性的氨基酸氧化酶,作为胶原和弹性蛋白的交联剂,对机体发育、组织结构稳定性、组织损伤修复等方面起着重要的作用。圆锥角膜患者泪液中LOXs的表达下降,阻碍细胞外基质胶原的合成,降低角膜力学特性,加剧圆锥角膜的发展。PGE2是一种重要的细胞生长和调节因子,是炎性反应中重要的炎性介质之一,参与多种生理病理过程,在炎症反应中起关键作用,在圆锥角膜中pge2的表达量是正常角膜中的十倍,可能通过调节一些炎性因子的表达而参与到圆锥角膜的发生发展过程中。角膜属于典型的承载组织,机械牵拉会使角膜力学环境发生改变,造成角膜变薄,促使圆锥角膜的发生。因此炎性因子与机械牵拉均参与了圆锥角膜的发生发展过程。本文对正常角膜与圆锥角膜成纤维细胞进行体外培养,检测不同浓度的pge2和拉伸加载对角膜成纤维细胞中loxs家族mrna表达的影响。实验分为三组,第一组为分别在0h、6h和12h时,loxs家族mrna随时间的变化情况;第二组加入浓度为0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml和50ng/ml的pge2,检测pge2浓度对角膜中loxs家族mrna表达的影响;第三组为加入浓度10ng/ml的pge2,在12%的拉伸幅度下拉伸12h,检测pge2与拉伸载荷联合作用对角膜中loxs家族mrna表达的影响。本研究使用flexercell4000柔性基底牵拉系统对细胞进行拉伸,模拟损伤角膜成纤维细胞在体内的力学微环境,采用实时荧光定量pcr的方法对loxs家族mrna表达进行了检测,采用酶联免疫反应(elisa)检测pge2与拉伸载荷联合作用对角膜中loxs蛋白的含量。研究结果表明:正常角膜与圆锥角膜成纤维细胞均可表达loxs;圆锥角膜loxs表达均低于正常角膜;低浓度pge2(1ng/ml)可上调正常角膜成纤维细胞lox、loxl-2和loxl-4以及圆锥角膜成纤维细胞loxs家族mrna的表达;但pge2对loxs家族mrna表达不具有明显的浓度依赖性;与对照组比较,单独机械拉伸使正常角膜loxl-2和loxl-4mrna表达上调,使圆锥角膜LOXL-3和LOXL-4 mRNA表达下调;机械牵拉与PGE2联合作用使正常角膜LOXL-4 mRNA表达下调,使圆锥角膜除LOXL-1之外的所有LOXs mRNA下调。LOXs蛋白含量整体趋势与基因的表达情况基本一致。LOXs mRNA的表达随时间变化没有明显的时间依赖性。根据实验结果,圆锥角膜在炎症和牵拉同时存在的条件下,LOXs表达降低,导致角膜胶原交联发生障碍,角膜结构发生改变,力学稳定性下降,在眼内压的作用下则容易发生膨隆,这可能是圆锥角膜的致病与发展机制之一。
【关键词】：圆锥角膜 前列腺素E2 赖氨酰氧化酶 炎性因子 机械牵拉 角膜成纤维细胞
【学位授予单位】：太原理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R772.2
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-10
• 英文缩略词表10-13
• 第一章 绪论13-29
• 1.1 问题的提出与研究意义13-16
• 1.2 赖氨酰氧化酶16-22
• 1.2.1 赖氨酰氧化酶与圆锥角膜18-19
• 1.2.2 赖氨酰氧化酶与其他眼科疾病19-21
• 1.2.3 赖氨酰氧化酶的作用21-22
• 1.3 角膜基质层的结构22-25
• 1.4 角膜成纤维细胞25-26
• 1.5 圆锥角膜与炎性因子26-28
• 1.6 本文的研究目的及内容28-29
• 第二章 实验材料及方法29-41
• 2.1 实验试剂与仪器29-30
• 2.1.1 实验试剂29
• 2.1.2 实验仪器与耗材29-30
• 2.2 实验方法30-40
• 2.2.1 实验分组30
• 2.2.2 角膜成纤维细胞的培养30-31
• 2.2.3 Flexercell 4000柔性基底牵拉系统31-32
• 2.2.4 不同浓度PGE2对细胞活性的影响32-33
• 2.2.5 总RNA的提取33-34
• 2.2.6 RNA浓度与纯度的鉴定34
• 2.2.7 cDNA的合成34
• 2.2.8 引物的合成34-35
• 2.2.9 实时荧光定量PCR35-36
• 2.2.10 BCA蛋白定量36-37
• 2.2.11 人赖氨酰氧化酶蛋白酶联免疫分析37-40
• 2.3 统计学处理40
• 2.4 本章小结40-41
• 第三章 机械牵拉与PGE2联合作用对圆锥角膜成纤维细胞LOXs家族表达的影响41-55
• 3.1 时间的改变对圆锥角膜成纤维细胞LOXs家族mRNA表达的影响41-44
• 3.2 不同浓度的PGE_2对圆锥角膜成纤维细胞LOXs家族mRNA表达的影响44-47
• 3.3 机械牵拉和PGE_2联合作用对圆锥角膜成纤维细胞LOXs家族mRNA表达的影响47-49
• 3.4 机械牵拉和PGE_2联合作用对圆锥角膜成纤维细胞LOXs蛋白含量的影响49-52
• 3.5 讨论52-53
• 3.6 本章小结53-55
• 第四章 全文总结55-59
• 参考文献59-69
• 致谢69-71
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文71

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