Netrin-1促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复及作用机制的研究

发布时间：2017-04-27 19:09

  本文关键词：Netrin-1促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复及作用机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的通过体外实验(小鼠角膜上皮干/祖细胞系,TKE2细胞)与体内实验(STZ,链脲菌素,诱导I型糖尿病小鼠),观察Netrin-1(神经轴突导向因子)对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复过程角膜上皮愈合、炎症反应及神经修复的作用,并探讨其作用机制。方法1.体外实验体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞(TKE2细胞)及原代三叉神经节细胞。实验分组:正常组、甘露醇组、高糖组及高糖+Netrin-1组。检测正常组与高糖组TKE2细胞内源性Netrin-1表达量的差异。高糖环境培养TKE2细胞,进行如下检测:Netrin-1对TKE2细胞迁移能力与增殖能力的影响;Netrin-1对TKE2细胞ERK及EGFR信号通路的作用;Netrin-1对TKE2细胞氧化应激反应的影响。高糖环境培养原代三叉神经节细胞,观察Netrin-1对三叉神经节细胞轴突生长的影响。2.体内实验选取链脲佐菌素(STZ)诱导的C57/BL6 I型糖尿病小鼠与正常C57/BL6小鼠。建立小鼠角膜上皮损伤模型,给药方式为结膜下注射。实验分组:正常组、糖尿病组、糖尿病+Netrin-1组、糖尿病A2BAR拮抗剂组、糖尿病UNC5B中和抗体组。检测正常与糖尿病小鼠角膜上皮内源性Netrin-1表达量差异;观察Netrin-1对糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合速率的影响;检测Netrin-1对糖尿病小鼠角膜上皮损伤后炎症反应的影响;观察Netrin-1对糖尿病小鼠角膜上皮损伤后神经纤维修复的作用;检测Netrin-1影响糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的相关信号通路与主要作用受体。结果1.体外实验部分通过对TKE2细胞的实验研究,结果发现:与正常组相比,高糖组TKE2细胞内源性Netrin-1的表达量较少(P0.05);细胞划痕后,高糖组TKE2细胞的迁移面积明显低于正常组与高糖+Netrin-1组(P0.05);细胞增殖实验显示:高糖组TKE2细胞数量较正常组与高糖+Netrin-1组明显减少(P0.05);外源性Netrin-1能激活并上调正常组TKE2细胞中p-ERK与p-EGFR的表达量;高糖组TKE2细胞p-ERK与p-EGFR的表达量较正常组明显降低(P0.05),高糖+Netrin-1组明显高于正常组与高糖组(P0.01)。高糖组TKE2细胞ROS表达水平明显高于正常组与高糖+Netrin-1组(P0.01);高糖组TKE2细胞GSH表达水平明显低于正常组与高糖+Netrin-1组(P0.01)。高糖组原代培养的三叉神经节细胞轴突生长的长度与正常组相比较短(P0.05),高糖+Netrin-1组与高糖组相比明显增长(P0.05)。2.体内实验部分通过对正常与糖尿病小鼠进行的实验研究发现:与正常组相比,糖尿病组小鼠角膜上皮内源性Netrin-1表达量明显减少(P0.05);小鼠角膜上皮刮除后,糖尿病组的愈合速率与正常组相比明显减慢(P0.05),糖尿病+netrin-1组与糖尿病组相比明显增快(P0.05);糖尿病组小鼠角膜上皮刮除后24h促炎性细胞相关因子COX-2、CXCL10、CXCL11、CXCL12表达量、48h中性粒细胞浸润数量、M1型巨噬细胞标记i NOS、IL-12的表达量及上皮刮除后72h M1型巨噬细胞数量较正常组显著增高(P0.05),而糖尿病+Netrin-1组与糖尿病组相比则显著下降(P0.05);糖尿病组小鼠角膜上皮刮除后72h角膜M2型巨噬细胞及其标记物Arginase-1与IL-10表达量较正常组显著减少(P0.05),而糖尿病+Netrin-1组较糖尿病组显著增加(P0.05);小鼠角膜上皮刮除后糖尿病小鼠角膜上皮神经再生的长度明显较正常组缩短(P0.05),糖尿病+netrin-1组较糖尿病组显著增长。糖尿病组小鼠角膜损伤后再生上皮p-ERK与p-EGFR的表达强度较正常组明显减弱,糖尿病+netrin-1组较糖尿病组相比显著增强;糖尿病A2BAR拮抗剂组小鼠角膜上皮愈合速率与糖尿病+Netrin-1组相比明显减慢(P0.05),再生角膜上皮p-ERK的表达量下降,上皮损伤后72h角膜M2型巨噬细胞的数量减少;糖尿病UNC5B中和抗体组小鼠与糖尿病+Netrin-1组相比无显著差异。结论Netrin-1促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合;Netrin-1抑制糖尿病小鼠角膜上皮损伤后早期炎症反应及诱导M1型巨噬细胞转化M2型巨噬细胞以促进炎症消退;Netrin-1可促进角膜神经的再生与修复;Netrin-1促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复与其激活p-ERK与p-EGFR信号通路有关;Netrin-1对p-ERK信号通路的激活、抑制炎性细胞浸润与促进巨噬细胞转型可能是通过A2BAR受体介导的。此外,Netrin-1促进糖尿病小鼠角膜上皮的修复可能与其抗氧化应激作用有关。结论
【关键词】：Netrin-1 I型糖尿病小鼠 高糖 p-ERK p-EGFR A2BAR 巨噬细胞 三叉神经节细胞
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R772.2
【目录】：

• 摘要9-12
• Abstract12-15
• 主要符号表15-16
• 引言16-18
• 第一部分 体外细胞实验18-39
• 第1章 材料与方法18-31
• 1.1 材料与试剂18-22
• 1.2 实验方法22-31
• 第2章 结果31-39
• 2.1 高糖环境对TKE2细胞内源性Netrin-1 表达的影响31-32
• 2.2 外源性Netrin-1 对高糖环境TKE2细胞迁移能力的影响32-33
• 2.3 外源性Netrin-1 对高糖环境TKE2细胞增殖能力的影响33-34
• 2.4 外源性Netrin-1 对TKE2细胞ERK与EGFR信号通路的影响34-35
• 2.5 外源性Netrin-1 对高糖环境TKE2细胞ERK与EGFR信号通路的影响35-36
• 2.6 外源性Netrin-1 对高糖环境TKE2细胞氧化应激反应的影响36-37
• 2.7 外源性Netrin-1 对高糖环境原代培养三叉神经节细胞的影响37-39
• 第二部分 体内动物实验39-55
• 第1章 材料与方法39-47
• 1.1 材料与试剂39-41
• 1.2 实验方法41-47
• 第2章 结果47-55
• 2.1 内源性Netrin-1 在正常与糖尿病小鼠角膜上皮表达差异47-48
• 2.2 Netrin-1 对糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合速率的影响48-49
• 2.3 Netrin-1 对糖尿病小鼠角膜上皮ERK与EGFR信号通路的影响49
• 2.4 Netrin-1 对糖尿病小鼠角膜上皮损伤后炎性细胞浸润及巨噬细胞转型的影响49-52
• 2.5 Netrin-1 影响糖尿病小鼠角膜上皮损伤的修复及M2型巨噬细胞的转型与其受体A2BAR的关系52-54
• 2.6 Netrin-1 对糖尿病小鼠角膜上皮损伤后神经修复的影响54-55
• 讨论55-58
• 结论58-59
• 参考文献59-63
• 综述63-77
• 参考文献70-77
• 攻读学位期间取得的研究成果77-79
• 攻读学位期间发表的论文77-78
• 攻读学位期间申请的专利78
• 攻读学位期间会议发言78
• 硕士期间参与的课题78-79
• 致谢79

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1 李拥军;柳夏林;刘昌伟;管珩;林清;;1型糖尿病小鼠下肢缺血恢复受损的机制[J];中国医学科学院学报;2007年06期

2 李予蓉,谢艳华,范风云,王思功,曾桂英;中药双参胶囊对小鼠实验性糖尿病的影响[J];第四军医大学学报;2000年02期

3 逄兵,金泰^

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