HDACs在斑马鱼视网膜再生中的作用研究

发布时间：2021-09-17 19:40

　　目的 :探究组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）在斑马鱼视网膜针刺损伤后的表达及其在视网膜再生中的作用。方法:（1）通过定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）检测视网膜损伤后HDACs的mRNA表达水平;（2）5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU）免疫荧光分析视网膜Müller细胞（Müller glia, MG）和祖细胞（MG-derived progenitor cells, MGPCs）的增殖;（3）利用在去分化MG中特异表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的Tg（1016tuba1a:GFP）转基因斑马鱼检测MG细胞的去分化;（4）通过BrdU谱系追踪MGPCs并进行增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）免疫荧光分析MGPCs的细胞周期进程;（5）qPCR检测抑制HDACs后视网膜内细胞周期相关基因的表达变化。结果:（1）视... 

【文章来源】：南通大学学报(医学版). 2020,40(04)

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【部分图文】：

hdac基因在斑马鱼视网膜针刺损伤后的表达

已有研究[13-14]证实斑马鱼视网膜损伤后4 dpi内核层(inner nuclear layers,INL)中Brd U+的细胞是多能性的MGPCs。为进一步研究HDACs在视网膜再生中的功能，利用HDACs的抑制剂TSA和VPA来抑制HDACs的作用。斑马鱼在视网膜损伤后每日腹腔注射溶剂对照二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)或不同浓度的TSA(0.05、0.5和5μmol/L)和VPA(2、20和200μmol/L)，在4 dpi先腹腔注射Brd U标记MG-PCs,3 h后收取眼球并进行冰冻切片。Brd U免疫荧光染色显示TSA和VPA处理剂量依赖的减少了4 dpi INL Brd U+细胞的数量(图2)，提示斑马鱼视网膜损伤后MGPCs的形成需要HDACs。2.3 HDACs促进斑马鱼视网膜MG的增殖

为了解HDACs是否影响MGPCs的细胞周期进程，本研究进行了谱系追踪实验。在2 dpi腹腔注射Brd U标记增殖的MGPCs，然后在4 dpi通过冰冻切片进行PCNA免疫荧光染色(图4A)。在4 dpi视网膜内PCNA+Brd U+细胞数量/Brd U+细胞数量的比值可以反映Brd U标记的MGPCs后代在4 dpi时仍处于细胞周期中的比例。实验结果显示TSA处理显著降低了该比值(图4B～C)，提示MGPCs的细胞周期进程是需要HDACs的。进一步通过q PCR分析了TSA对视网膜内细胞周期相关基因表达的影响，q PCR结果显示TSA处理导致p21、p27和p57 3个周期素依赖激酶抑制物(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的表达显著升高，而细胞周期素ccnd1的表达显著下调(图4D)，这与观察到的增殖抑制表型相一致。TSA处理也导致2 dpi细胞周期素ccna2和ccne1的表达升高(图4D)。这些结果显示TSA处理干扰了细胞周期相关基因的正常表达，提示HDACs可能通过影响细胞周期相关基因的表达调控MGPCs的细胞周期进程。3 讨论

【参考文献】：
期刊论文
[1]Expression of SoxC Transcription Factors during Zebrafish Retinal and Optic Nerve Regeneration[J]. Zhaoxia Mu,Shuqiang Zhang,Chunjiao He,Haitao Hou,Dong Liu,Nan Hu,Hui Xu.  Neuroscience Bulletin. 2017(01)



本文编号：3399373