Hsf4对溶酶体活性的调控

发布时间：2017-05-06 18:12

  本文关键词：Hsf4对溶酶体活性的调控，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景眼晶状体蛋白变性形成非透明样斑块组织,致使光线不能投射到视网膜形成图像,这一眼部疾病称为白内障。白内障发病率达到60%-80%,是导致失明的主要原因,将近50%的失明是由白内障引起的。正常情况下,人眼中的晶状体组织是透明的,光线能够透过它到达视网膜,使人们清晰地看到物体。晶状体由两种细胞组成,前囊立方上皮细胞和纤维细胞。赤道区前囊上皮细胞具有无限增生的能力,并且能持续向纤维细胞分化,因此可知晶状体是一个终生生长的器官。纤维细胞分为前囊上皮下的皮质纤维细胞和核心区的终末分化纤维细胞,终末分化的纤维细胞能合成大量折叠有序的晶状体蛋白,并且主动失去细胞内的膜性亚细胞器(包括细胞核、内质网、线粒体、高尔基体等),形成能折射光线的中心透明区(也称OFZ,organelle free zone),但纤维细胞终末分化的去膜性亚细胞器的机理还不清楚。有报道发现溶酶体介导的自噬和泛素-蛋白酶体是调控去亚细胞器的主要通路,溶酶体腔内的DNaseⅡbeta和水解酶参与晶状体纤维细胞核和膜性亚细胞器的降解,基因敲除DNaseⅡbeta的小鼠晶状体纤维细胞脱核障碍,形成非透明的白内障。然而,在终末纤维细胞分化过程中,调控溶酶体活性的信号通路仍不清楚。热休克转录因子4是热休克转录因子家族成员之一,该家族转录因子能感受外界和细胞内源性应激刺激,上调热休克蛋白家族成员的表达,后者通过对变性蛋白的复性、分割和降解,达到对细胞生命的保护,这一过程成为热休克应激反应。热休克转录因子4主要表达在晶状体、脾、心脏和脑组织中。Hsf4基因突变与家族显性遗传性白内障的发生密切相关,基因敲除Hsf4的小鼠发生先天性白内障,主要表现为出生后小鼠晶状体纤维细胞分化障碍,终末分化纤维细胞脱核延迟。Hsf4主要表达在晶状体上皮细胞和纤维细胞的核内。有报道发现Hsf4参与调控DNaseⅡbeta的基因表达。因此我们推论Hsf4通过调控纤维细胞溶酶体活性继而参与终末分化纤维细胞的脱核作用。本课题将设计一系列实验验证Hsf4参与调控纤维细胞溶酶体活性的分子机制。目的应用小鼠晶状体上皮细胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b研究Hsf4调控溶酶体活性的分子机制。方法1.收集mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b细胞,用Western-blot检测细胞内LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比例;应用免疫荧光观察LC3自噬活化颗粒的数量,揭示Hsf4对自噬通路的调控作用。2.应用表达GFP-LC3质粒,分别转染mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b细胞,用雷帕霉素Rapamycin和氯喹Chloroquine分别处理细胞,Rapamycin激活细胞内的自噬,Chloroquine则抑制溶酶体对自噬小体的降解,应用Western-blot检测GFP-LC3分子中GFP的降解速度,观察Hsf4对溶酶体活性的检测;3.不同浓度Chloroquine处理转染GFP-LC3的mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b,Western-blot观察游离GFP的变化;4.用Western-blot、免疫荧光检测溶酶体相关膜蛋白LAMP1、LAMP2(溶酶体标记物)在mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b的表达和定位,测定Hsf4对溶酶体数量和活性的调控;5.用Magic Red染色,免疫荧光检测溶酶体内Cathepsin B的活性,从而检测mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b内溶酶体Cathepsin B的活性是否受Hsf4b调控;6.免疫共沉淀CO-IP检测alpha B-crystallin是否与ATP6VIA有相互作用,验证Hsf4b是否通过其下游蛋白影响溶酶体活性。结果1.过表达Hsf4b导致细胞内自噬反应增强;2.Rapamycin短时间处理,晶状体上皮细胞自噬增强。处理时间延长后,mlec-HA-Hsf4b的LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ明显降低,可能由于Hsf4b促进溶酶体活性将更多的LC3-Ⅱ降解;3.Hsf4b能增加GFP-LC3分子中GFP在溶酶体中的降解。晶状体上皮细胞经雷帕霉素(Rapamycin)处理后,细胞内溶酶体活性整体升高;4.不同浓度氯喹(Chloroquine)处理两种晶状体上皮细胞,可明显的增加GFP-LC3在mlec-HA-Hsf4b细胞内的堆积,说明Hsf4b能提高溶酶体对GFP分子的降解速度;5.Magic Red染色发现Hsf4b能增加Cathepsin B的蛋白酶水解活性,直接说明Hsf4b增强溶酶体活性;6.通过Western-blot检测溶酶体相关膜蛋白LAMP1、LAMP2在晶状体上皮细胞的表达发现,Hsf4b不影响溶酶体的数量,但通过免疫荧光发现Hsf4b影响溶酶体的定位方式。LAMP1以聚积状态分布于在mlec-Hsf4b-/-核周,而均匀分布于mlec-HA-Hsf4b核周;LAMP2在mlec-Hsf4b-/-核周均匀分布,而在mlec-HA-Hsf4b细胞质和核内都存在;7.CO-IP检测暂未发现Hsf4b下游基因cryαb与ATP6VIA有相互作用,仍需进一步确定。结论1.Hsf4促进细胞自噬的发生;2.Hsf4参与上调晶状体上皮细胞内溶酶体的生物活性。
【关键词】：Hsf4 自噬 溶酶体活性 晶状体发育 白内障
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词表12-13
• 引言13-17
• 1 材料、仪器17-23
• 1.1 主要材料与试剂17-23
• 1.1.1 细胞株、细菌以及质粒来源17
• 1.1.2 主要试剂17-18
• 1.1.3 主要试剂的配制18-21
• 1.1.4 主要仪器21-23
• 2 实验方法23-31
• 2.1 质粒的转化与转染23-24
• 2.1.1 质粒的转化23
• 2.1.2 质粒转染细胞23-24
• 2.2 细胞培养24-25
• 2.2.1 细胞复苏24
• 2.2.2 细胞传代24
• 2.2.3 细胞计数24-25
• 2.2.4 细胞冻存25
• 2.3 Western Blot25-28
• 2.3.1 提取细胞蛋白25
• 2.3.2 测蛋白浓度25-26
• 2.3.3 蛋白质凝胶电泳26-28
• 2.4 提取细胞RNA28-29
• 2.5 免疫荧光29
• 2.6 免疫共沉淀29-31
• 3 实验结果31-41
• 3.1 Hsf4增强自噬的发生31-32
• 3.2 Hsf4促进雷帕霉素（Rapamycin）诱导的LC3-Ⅱ的降解32-33
• 3.3 Hsf4增强溶酶体介导的游离GFP的降解33-34
• 3.4 氯喹（Chloroquine）影响Hsf4介导的溶酶体活性34-36
• 3.5 Hsf4增强溶酶体活性36-37
• 3.6 Hsf4不影响溶酶体数量37-39
• 3.7 检验alpha B-crystallin是否与ATP6VIA相互作用39-41
• 4 讨论41-45
• 结论45-47
• 参考文献47-49
• 综述49-61
• 参考文献58-61
• 致谢61-63
• 在校期间获得的奖励和科研成果63-64

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本文编号：348893