携线粒体DNA A1555G突变的聋病患者特异性iPS细胞系的建立与鉴定

发布时间：2017-07-15 21:20

  本文关键词：携线粒体DNA A1555G突变的聋病患者特异性iPS细胞系的建立与鉴定

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【摘要】：聋病是全球性公共卫生问题。目前全球有3.6亿聋病患者,其中我国有约3000多万聋病患者。耳聋是由遗传和环境因素引起的,其中50%的耳聋患者是由遗传因素造成的,线粒体基因编码的12S rRNAA15555G突变是氨基糖苷类抗生素诱导的非综合征耳聋的重要原因。由于线粒体的多拷贝性和双重膜结构,目前尚缺乏有效的技术手段对线粒体基因进行定点突变或改造或构建相应的细胞模型和动物模型,严重制约线粒体基因突变相关的疾病发生发展机制研究。 诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPS cells or iPSCs)是一类通过在体细胞中人为表达特定转录因子,诱导体细胞重编程而获得的类似胚胎干细胞的细胞类型。患者特异性iPS细胞则是将患者的体细胞诱导成iPS细胞。其原代细胞来源于患者本身,克服了动物模型存在的物种差异性；原代细胞来源广泛,克服了取材上的困难；更重要的是还保持患者基因组尤其是致病基因不变,为各种疾病的研究提供一个良好的细胞模型。 本论文通过收集携线粒体DNA A1555G突变的聋病患者及与其相同线粒体基因组单体型的正常人尿液中的肾小管上皮脱落细胞,经离体培养扩增,建立携mtDNAA1555G突变的聋病患者尿液细胞系正常人尿液细胞系。然后利用逆转录病毒作为载体将四个转录因子(Oct-4, Sox-2, c-Myc, Klf4)导入尿液细胞,建立聋病特异性iPS细胞系和正常人iPS细胞系。光学显微镜观察,iPS细胞聚集形成类似ES细胞紧凑的多细胞集落,呈现克隆边缘明显,核质比高的特点。通过碱性磷酸酶染色(AP染色)、荧光定量PCR、甲基化分析、免疫荧光实验、插入鉴定、核型分析等方法鉴定,显示上述细胞具有较高的碱性磷酸酶活性；内源多能性基因的表达量显著高于原代尿液细胞,外源多能性基因沉默；Nanog和Oct-4基因启动子区为去甲基化状态,尿液细胞为高甲基化状态；细胞表达ES细胞特异性细胞表面标志物,包括SSEA3、SSEA4,肿瘤相关抗原TRA-1-60、TRA-1-81,以及核蛋白NANOG;四个外源性转录因子基因已经整合到iPS细胞的染色体基因组中；细胞核型正常,为46条染色体、XY型。体外拟胚体诱导和体内畸胎瘤形成实验表明上述iPS细胞具有分化为三胚层组织细胞的潜能。同时,对诱导出的iPS细胞系进行全序列线粒体DNA的PCR测序,显示患者iPS细胞仍然保留A1555G突变并且和原代尿液细胞相比未出现新的突变。 综上所述,本论文成功建立了携线粒体DNAA1555G突变的聋病特异性iPS细胞系。为深入阐明聋病的致病机制及药物筛选提供可靠的细胞模型,为聋病的诊断和治疗开拓了新思路。
【关键词】：聋病 线粒体DNA A1555G突变 患者特异性iPS细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.43
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文缩略词10-15
• 第一章 文献综述15-31
• 1 引言15
• 2 线粒体疾病15-16
• 3 线粒体聋病16-20
• 3.1 聋病的致病因素16-17
• 3.2 与非综合征性耳聋相关的线粒体12S rRNA基因突变17-18
• 3.3 氨基糖苷类药物性耳聋与线粒体12S rRNA基因A1555G突变18-19
• 3.4 线粒体单体型对mtDNA突变致聋的影响19-20
• 4 患者特异性iPS细胞模型20-30
• 4.1 iPS细胞20-21
• 4.2 患者特异性iPS细胞21-26
• 4.3 患者特异性iPS细胞作为疾病模型的优势26-27
• 4.4 患者特异性iPS细胞在线粒体疾病研究中的应用27-30
• 5 总结30-31
• 第二章 实验研究31-84
• 1 引言31-32
• 2 实验材料32-38
• 2.1 组织标本和细胞32
• 2.2 质粒32
• 2.3 实验试剂及配置32-37
• 2.3.1 细胞培养液配置32-35
• 2.3.2 实验试剂配制35-36
• 2.3.3 实验试剂36-37
• 2.4 试剂盒37
• 2.5 实验仪器37-38
• 3 实验方法38-63
• 3.1 尿液细胞的收集和分离38-39
• 3.1.1 尿液样本的采集38
• 3.1.2 尿液细胞的分离38-39
• 3.1.3 尿液细胞的传代39
• 3.1.4 尿液细胞的冻存39
• 3.2 CF-1孕鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备39-42
• 3.2.1 CF-1孕鼠胚胎成纤维细胞的分离39-40
• 3.2.2 细胞的冻存40-41
• 3.2.3 饲养层细胞的制备41-42
• 3.3 逆转录病毒的包装和感染42-44
• 3.3.1 pMX逆转录病毒载体质粒的转化和抽提42
• 3.3.2 逆转录病毒的包装42-43
• 3.3.3 病毒的收集和感染43
• 3.3.4 感染后细胞的接种43-44
• 3.4 iPS细胞克隆的挑取、维护与培养44-47
• 3.4.1 iPS单克隆的挑取44
• 3.4.2 iPS细胞的有饲养层培养44-46
• 3.4.2.1 iPS细胞的传代44-45
• 3.4.2.2 iPS细胞的维护45
• 3.4.2.3 iPS细胞的冻存45
• 3.4.2.4 iPS细胞的复苏45-46
• 3.4.3 iPS细胞的无饲养层培养46-47
• 3.4.3.1 iPS细胞的传代46
• 3.4.3.2 iPS细胞的维护46-47
• 3.4.3.3 iPS细胞的冻存47
• 3.4.3.4 iPS细胞的复苏47
• 3.5 iPS细胞的生物学鉴定47-63
• 3.5.1 碱性磷酸酶检测(AP染色)47-48
• 3.5.2 免疫荧光检测48-49
• 3.5.3 内源多能性基因和外源编程基因相对表达量的检测49-52
• 3.5.3.1 细胞收集49
• 3.5.3.2 RNA提取49-50
• 3.5.3.3 反转录50
• 3.5.3.4 荧光定量PCR检测50-52
• 3.5.4 外源编程基因的插入鉴定52-53
• 3.5.4.1 DNA提取52
• 3.5.4.2 PCR反应52-53
• 3.5.4.3 1%琼脂糖凝胶电泳53
• 3.5.5 iPS细胞的核型分析53-54
• 3.5.6 多能性基因(Oct4、Nanog)启动子的甲基化水平检测54-59
• 3.5.6.1 DNA提取54
• 3.5.6.2 DNA样品处理54
• 3.5.6.3 启动子区域的PCR扩增54-56
• 3.5.6.4 PCR产物的胶回收56-57
• 3.5.6.5 T载体的连接与转化57-58
• 3.5.6.6 挑菌与菌落PCR58
• 3.5.6.7 数据处理58-59
• 3.5.7 体外分化拟胚体59-60
• 3.5.7.1 拟胚体的培养59
• 3.5.7.2 多能性基因的表达检测59-60
• 3.5.8 体内分化畸胎瘤60-61
• 3.5.9 线粒体DNA A1555G突变的鉴定61-62
• 3.5.9.1 DNA提取(TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit)61-62
• 3.5.10 线粒体结构的透射电子显微镜观察62-63
• 4 实验结果与分析63-80
• 4.1 临床资料63-65
• 4.2 尿液细胞的收集、分离及培养65-66
• 4.3 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备66-67
• 4.4 病毒的包装、收集和滴度测定67
• 4.5 尿液细胞的逆转录病毒感染67-68
• 4.6 iPS克隆的形成68-69
• 4.7 iPS细胞的培养69-70
• 4.8 碱性磷酸酶染色(AP染色)70
• 4.9 免疫荧光检测结果与分析70-71
• 4.10 内源多能性基因的表达与分析71-72
• 4.11 外源编程基因沉默的表达与分析72-73
• 4.12 外源编程基因的插入鉴定73
• 4.13 多能性基因(Oct-4,Nanog)启动子的甲基化水平检测73-74
• 4.14 核型分析74-75
• 4.15 体外分化拟胚体75-76
• 4.16 拟胚体中三胚层标记基因的表达76-77
• 4.17 体内分化畸胎瘤77-78
• 4.18 畸胎瘤组织的切片观察78-79
• 4.19 线粒体DNA A1555G突变的分析79
• 4.20 线粒体结果的透射电子显微镜观察79-80
• 5 讨论80-84
• 5.1 建立mtDNA A1555G突变导致的耳聋患者特异性iPS细胞系的意义80-81
• 5.2 利用尿液细胞作为原代细胞进行重编程的优势81-82
• 5.3 患者特异性iPS细胞作为疾病模型面临的挑战82-84
• 参考文献84-100
• 作者简历100

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2 曹新,邢光前,魏钦俊,卜行宽,王登元;线粒体DNA A1555G和961 insC双重突变导致的非综合征型遗传性耳聋[J];中华医学遗传学杂志;2004年06期

3 徐延军;曹菊阳;白琳娜;张昕;申卫东;冀飞;翟所强;袁慧军;;线粒体DNA A1555G和G7444A双重突变导致的非综合征型遗传性耳聋[J];中华耳科学杂志;2005年04期

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本文编号：545813