CNTF基因修饰的骨髓间充质干细胞对视神经钳夹伤大鼠RGCs的保护作用

发布时间：2017-07-16 09:23

  本文关键词：CNTF基因修饰的骨髓间充质干细胞对视神经钳夹伤大鼠RGCs的保护作用

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【摘要】：目的研究经慢病毒介导,大鼠睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)对SD大鼠视神经钳夹伤(Optic nerve crush,ONC)模型视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGCs)的保护作用。 方法 1、CNTF-BMSCs的体外构建：全基因合成含信号肽的大鼠CNTF基因编码序列并克隆至pHIV-dTomato慢病毒载体质粒,构建重组质粒CNTF-dTomato. CNTF-dTomato/pHIV-dTomato与慢病毒辅助质粒psPAX2及pMD2G共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得重组慢病毒CNTF-lenti及control-lenti.以CNTF-lenti/control-lenti感染SD大鼠BMSCs,构建CNTF-BMSCs及空载-BMSCs细胞,根据红色荧光蛋白dTomato表达情况确定病毒感染效率；未感染lenti的BMSCs为空白-BMSCs.ELISA法测定空白-BMSCs、空载-BMSCs及CNTF-BMSCs细胞培养液中CNTF的质量浓度。将CNTF-BMSCs向成骨和成脂方向诱导分化,以茜素红染色和油红-O染色对分化细胞进行鉴定。 2、ONC大鼠模型建立及实验动物分组：60只成年雄性SD大鼠随机分为空白对照组(A组)、手术对照组(B组)、PBS治疗组(C组)、空白-BMSCs治疗组(D组)、空载-BMSCs治疗组(E组)和CNTF-BMSCs治疗组(F组),每组各10只；B～F组均双眼建立ONC模型,夹伤后立即向C-F组大鼠玻璃体腔内注射相应液体各10μL。 3、玻璃体腔注射CNTF-BMSCs对ONC作用的观察：损伤后第14d处死各组大鼠,摘除双眼眼球。石蜡切片HE染色法观察大鼠视网膜形态变化,计数视网膜节细层细胞数。免疫荧光染色检测CNTF蛋白在视网膜的定位和表达情况。Westernblot法检测视网膜内Caspase-3和Brn3a蛋白的表达,照片扫描后采用Image J软件处理,计算各蛋白相对表达率。 结果 1、CNTF-BMSCs构建成功：质粒测序结果显示CNTF-dTomato质粒构建成功。重组慢病毒对BMSCs的感染率达95%。ELISA检测结果显示,感染后第1、2、3、7d,CNTF-BMSCs组细胞上清液中CNTF蛋白的质量浓度明显高于空白-BMSCs组及空载-BMSCs组,差异均有统计学意义(P均=0.000):CNTF-BMSCs组感染后2、3、7d细胞上清液中CNTF质量浓度均明显高于感染后1d,差异均有统计学意义(P=0.013,0.004,0.042)。CNTF-BMSCs经成脂培养基诱导后分化的细胞油红-O染色呈红色染色,经成骨培养基诱导后分化的细胞茜素红染色可见橘红染色。 2、成功建立ONC大鼠模型：HE染色结果显示,夹伤后14dB组、C组大鼠视网膜RGCs大量丢失,空泡化严重,细胞排列紊乱,显示ONC模型成功建立。D、E、F组大鼠视网膜RGCs空泡化减轻,细胞排列较整齐。 3、CNTF-BMSCs对RGCs的保护作用：节细胞层细胞计数结果显示,夹伤后14dB组、C组大鼠节细胞层细胞数较A组大幅减少,D、E、F组大鼠节细胞层细胞数高于B、C二组(P均0.05)。免疫荧光染色结果显示,夹伤后14dA组大鼠视网膜各层均无CNTF表达,F组视网膜节细胞层CNTF大量表达,其他各组视网膜节细胞层见少量CNTF表达。Western blot图片处理结果显示,夹伤后14dF组活性Caspase-3相对表达率低于其他各组(P均=0.000)；Bm3a相对表达率低于A组,高于其他各组(P均0.05)。 结论利用慢病毒载体可成功构建稳定过表达分泌型CNTF蛋白的大鼠BMSCs。玻璃体腔内注射CNTF-BMSCs可有效减少大鼠视神经钳夹伤后RGCs的丢失,对RGCs具有明显的保护作用。
【关键词】：睫状神经营养因子 慢病毒载体 骨髓间充质干细胞 视神经钳夹伤 视网膜神经节细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R779.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、CNTF基因修饰的大鼠BMSCs的构建15-29
• 1.1 对象和方法15-17
• 1.1.1 细胞、菌种与质粒15
• 1.1.2 主要试剂15-16
• 1.1.3 主要仪器、耗材16
• 1.1.4 主要溶液及缓冲液16-17
• 1.2 实验方法及流程17-23
• 1.2.1 大鼠BMSCs培养17-18
• 1.2.2 慢病毒穿梭质粒CNTF-dTomato的构建18-19
• 1.2.3 慢病毒的包装19-20
• 1.2.4 病毒原液的收获和浓缩20
• 1.2.5 重组慢病毒感染BMSCs20-21
• 1.2.6 CNTF蛋白表达检测21-22
• 1.2.7 CNTF-BMSCs诱导分化22
• 1.2.8 CNTF-BMSCs分化潜能的鉴定22
• 1.2.9 统计学分析方法22-23
• 1.3 实验结果23-27
• 1.3.1 慢病毒穿梭质粒CNTF-dTomato测序结果23-24
• 1.3.2 重组慢病毒感染BMSCs的荧光鉴定24
• 1.3.3 各组BMSCs不同时间细胞上清液中目的蛋白CNTF质量浓度24-26
• 1.3.4 CNTF-BMSCs分化为成骨细胞和脂肪细胞的鉴定26-27
• 1.4 讨论27-28
• 1.4.1 中枢神经系统疾病干细胞及神经营养因子治疗27
• 1.4.2 分泌型CNTF的表达27-28
• 1.5 小结28-29
• 二、CNTF基因修饰的BMSCs对大鼠RGCs的保护作用29-47
• 2.1 对象和方法29-33
• 2.1.1 实验动物及分组29
• 2.1.2 主要试剂29-30
• 2.1.3 主要仪器、耗材30-31
• 2.1.4 主要溶液及缓冲液31-33
• 2.2 实验方法33-39
• 2.2.1 ONC动物模型建立及玻璃体腔内给药33-34
• 2.2.2 注射细胞在眼内定位情况的观察34
• 2.2.3 视网膜组织病理学观察34-35
• 2.2.4 视网膜内CNTF表达检测35-36
• 2.2.5 视网膜组织蛋白提取36
• 2.2.6 BCA法测定蛋白浓度36-37
• 2.2.7 视网膜内Caspase-3、Brn-3a蛋白表达水平检测37-39
• 2.3 实验结果39-44
• 2.3.1 注射细胞眼内定位39
• 2.3.2 视网膜节细胞层细胞数变化39-40
• 2.3.3 视网膜形态学改变40-41
• 2.3.4 CNTF蛋白在视网膜的定位及表达41-43
• 2.3.5 视网膜Caspase-3、Brn3a蛋白表达43-44
• 2.4 讨论44-46
• 2.4.1 RGCs损伤模型44-45
• 2.4.2 CNTF-BMSCs对RGCs的保护作用45-46
• 2.4.3 CNTF-BMSCs抑制Caspase-3活化46
• 2.5 小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述 CNTF治疗视网膜损伤研究进展54-64
• 综述参考文献60-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：548015