慢病毒载体介导mTOR沉默对体外人晶状体上皮细胞作用的研究

发布时间：2017-08-06 09:08

  本文关键词：慢病毒载体介导mTOR沉默对体外人晶状体上皮细胞作用的研究

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【摘要】：目的： 后发性白内障(after cataract)也称为后囊膜混浊(posterior capsule opacification，PCO)，是白内障行超声乳化术或者囊外摘除联合人工晶状体植入术后最常见的并发症，也是术后引起视力再次降低的主要原因[1]。实验已证实术后残留的前囊膜或赤道部晶状体上皮细胞增殖、向后囊膜表面移行并有上皮细胞-间充质转变(epithelialmesenchymal transition,EMT)是PCO发生的主要原因。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是调节细胞周期进程和细胞生长增殖的信号汇聚点[2]。mTOR的表达能够促进细胞的黏附与移行，加快细胞增殖，参与上皮细胞向间叶细胞的转化，引起诸多生物改变[3]。基因沉默疗法(RNA interference,RNAi)是近年来十分热门的基因阻断技术，因其特异性强、效率高的优点而被广泛利用。本实验利用慢病毒为载体，筛选出效率最高的含有特异性抑制mTOR靶点的质粒转染至人晶状体上皮细胞中（Human Lens Epithelial Cell，HLEC），获得持续低mTOR稳定表达的细胞株。观察mTOR抑制后HLEC的增殖、凋亡及细胞周期的变化，同时观察HLEC上皮细胞标志物上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin,E-cad)和间质标志物平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin，a-SMA)的表达改变。该研究旨在进一步探讨利用RNA干扰技术成功沉默mTOR基因后对HLEC功能及细胞表型变化的影响，从而进一步在基因水平寻找针对后发障的预防治疗方法。 研究方法： 1.合成特异性抑制mTOR的shRNA重组质粒，通过转化入感受态细胞获得具有表达相应性状的感受态细胞。常规方法抽提各种质粒溶液-20℃保存备用。 2.按照比例加入质粒及PEI，充分反应后转染293T细胞。同时设置空白质粒、PBS缓冲液为两组对照组。多个时间点抽提培养液，无菌滤过收集，4℃保存即用。 3.将三个时间点收集到的抗mTOR慢病毒上清液等比混合，混合液按1：2体积加入融合度为80%的HLEC培养液中，24h换液后二次感染，48h后重复感染。阴性对照、空白对照亦按照1：2的体积分别加入融合度约为80%的HLEC的培养基中。24h、48h后两次重复感染。 4.收集各组细胞蛋白，Western blot在蛋白质水平检测mTOR表达量，分析抑制效率。在多组抗mTOR shRNA中筛选出抑制效率最高的一组。 5. RT-PCR、Western blot对筛选出来的已成功感染的人晶状体上皮细胞进行a-SMA、E-cadherin表达量的检测，与对照组比较。同时行CCK8检测细胞增殖能力，流式细胞检测仪检测细胞周期变化，均与对照组比较，结果使用统计软件分析。 结果： 1.制备重组质粒GV248.mTORshRNA，，测序结果显示目的核苷酸序列已与质粒成功连接。 2.光学显微镜下293T细胞生长状态良好，荧光显微镜下观察到实验组大部分293T细胞核内极亮绿色荧光，表达稳定。对照组细胞无绿色荧光。 3.实验组mTOR均比含空白靶点的阴性对照和正常细胞的表达量低，有两组几乎检测不到mTOR的表达，抑制效率较满意。 4.抑制效率最高的实验组RT-PCR、Western blot检测a-SMA表达比两组对照组明显减少，E-cadherin表达轻微上升，说明抑制mTOR表达一定程度上逆转了EMT。 5.抑制效率最高组行CCK8检测显示，实验组细胞增殖速率明显比对照组减慢（p0.05）。 6.流式细胞仪检测到实验组细胞周期大多停留在G1期，与对照组相比较有统计学意义（p0.05），多次重复实验结论一致。 结论： 1.本实验通过重组质粒GV248.mTORshRNA的制备，经由感染作用实现了体外对人晶状体上皮细胞中mTOR的表达的抑制。从而为阐述后发性白内障的发生及对其的特异性治疗手段提供了基本的实验支持。 2.构建慢病毒载体感染宿主细胞可作为长期稳定抑制靶基因的有效方法之一。 3.特异性抑制mTOR可以在一定程度的逆转人晶状体上皮细胞中上皮-间充质转化的进程，同时可以减缓细胞增殖，延长细胞周期，多点共同作用可作为防治后发障的潜在靶点之一。
【关键词】：shRNA 慢病毒载体 mTOR 后发性白内障 上皮-间充质转化
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文缩略词对照表9-10
• 前言10-14
• 参考文献12-14
• 第一部分 重组质粒 GV248.mTOR~(shRNA)的构建及慢病毒包装14-26
• 一、材料和方法14-20
• 二、结果20-23
• 讨论23-25
• 参考文献25-26
• 第二部分 慢病毒感染体外 HLEC 观察其形态功能及相关分子标记的改变26-41
• 一、实验细胞、仪器、试剂与实验方法26-28
• 二、实验方法28-32
• 三、实验结果32-38
• 讨论38-39
• 参考文献39-41
• 结论41-42
• 综述一42-49
• 参考文献45-49
• 综述二49-56
• 参考文献53-56
• 在读期间发表论文情况56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：629199