IFI16基因稳定表达抑制Hep-2细胞软琼脂集落形成

发布时间：2017-08-11 00:21

  本文关键词：IFI16基因稳定表达抑制Hep-2细胞软琼脂集落形成

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【摘要】：喉鳞癌是头颈部一种常见的恶性肿瘤,其发病率呈现逐年上升的趋势,并趋向于年轻化,传统的治疗方法对中、晚期喉癌的治疗疗效并不理想,且毒副作用很大。近年来兴起的肿瘤综合治疗正愈来愈受到人们的重视,基因治疗就是其中的治疗方法之一,因此,寻找喉癌发病的相关基因,对于揭示喉癌的发病分子机理以及喉癌早期诊断与预防都有很重要的作用。已有研究资料表明喉癌的发生除了与p53等肿瘤抑制基因有关,还与干扰素可诱导的IFI-200家族成员IFI16基因有关。目前已知IFI16基因具有抗乳腺癌、前列腺癌的作用,并且在头颈部鳞状细胞癌HNO136细胞中表现出抑制细胞生长的作用。 除此之外,IFI16基因在癌细胞中表达很低。而核因子Nuclear factor-kappa-B在癌细胞中呈现高表达状态,广泛参与细胞的免疫和炎症反应。已有研究证明NF-κB核因子能促进癌细胞的增殖、侵润和转移,加强促进癌细胞继续发展的抗凋亡蛋白质表达,还与细胞癌基因的表达息息相关,并有抗细胞炎症、抗细胞凋亡的作用。目前,针对于药物抑制转录因子NF-κB的活性作用,来探究肿瘤的药物治疗方法,这也很可能是喉鳞癌Hep-2细胞潜在、有效的临床治疗方法。PDTC是NF-κB的有效抑制剂。近年来,有研究报道姜黄素Curcumin也有抑制NF-kappa-B转录因子的作用,所以,本实验就利用PDTC和Curcumin在喉鳞癌Hep-2细胞中联合作用抑制NF-κB核因子的活性,来检测Hep-2细胞的增殖能力。结果显示,Curcumin协同PDTC作用于Hep-2细胞,明显降低了Hep-2细胞的增殖能力,并能诱导Hep-2细胞发生凋亡。这一结果为本实验室后续的研究工作打下了一定的理论和实践基础,对喉鳞癌的临床治疗有着非常重要的促进作用。 本研究将RT-PCR扩增得到的IFI16基因克隆到pEGFP-C1载体上构建重组质粒pEGFP-IFI16,重组质粒pEGFP-IFI16经磷酸钙转染导入Hep-2细胞后,经G418筛选得到IFI16基因稳定表达的Hep-2/pEGFP-IFI16细胞系,利用荧光显微镜和半定量RT-PCR观察分析IFl16基因在Hep-2细胞中稳定表达情况,以及分析IFI16基因稳定表达对Hep-2细胞软琼脂集落形成的影响,并进一步用流式细胞仪分析IFI16基因稳定表达对Hep-2细胞凋亡的影响。pEGFP-IFI16重组质粒转染Hep-2细胞后,在荧光显微镜下观察显示有明显的绿色荧光信号,转染Hep-2细胞后半定量RT-PCR分析IFI16基因mRNA水平结果显示条带亮度明显升高,软琼脂细胞集落形成试验结果显示Hep-2/pEGFP-IFI16细胞系集落形成数目明显少于对照细胞系Hep-2/pEGFP-C1的集落数(P0.01),凋亡分析结果显示Hep-2/pEGFP-IFI16细胞系的凋亡细胞百分率明显高于对照细胞系Hep-2/pEGFP-C1的凋亡率。上述研究结果说明,成功构建了能在Hep-2细胞中稳定表达IFI16基因的pEGFP-IFI16重组质粒,IFI16基因稳定表达能抑制Hep-2细胞软琼脂集落形成并能诱导Hep-2细胞发生凋亡。另外,Hep-2/pGreenPuro-IFI16细胞系也正在构建中。 本实验通过构建pEGFP-IFI16重组质粒建立IFI16基因稳定表达的Hep-2/pEGFP-IFI16细胞系,来探讨IFI16基因稳定表达对喉癌细胞系Hep-2细胞生物学特征软琼脂集落形成及凋亡的影响。并且想通过基因沉默技术使IFI16基因表达沉默,反向验证IFI16基因稳定表达在Hep-2细胞脂集落形成中的作用。从以上结果可以看出IFI16基因稳定表达能抑制Hep-2细胞软琼脂集落形成可能是通过促进Hep-2细胞发生凋亡而介导的,这也为进一步阐明IFI16基因稳定表达能抑制Hep-2细胞软琼脂集落形成的分子机制奠定基础。
【关键词】：IFI16 Hep-2 软琼脂集落形成 细胞凋亡 流式细胞仪 NF-kappa-B
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.65
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-11
• 第一章 肿瘤的综合治疗现状及其发展趋势(文献综述)11-20
• 1.脾瘤治疗的历史背景11-13
• 1.1 肿瘤的传统治疗方法11-13
• 1.1.1 手术治疗12
• 1.1.2 放射治疗12
• 1.1.3 化学治疗12-13
• 1.2 肿瘤多学科综合治疗概念的形成13
• 2. 肿瘤综合治疗的现状13-14
• 3. 肿瘤的综合治疗手段14-19
• 3.1 手术与放疗、化疗联合作用14
• 3.2 生物治疗与放射治疗、化学治疗、中医药治疗联合作用14-15
• 3.2.1 免疫治疗与放射治疗联合作用15
• 3.2.2 免疫治疗与化学治疗联合作用15
• 3.2.3 免疫治疗与中医药治疗联合作用15
• 3.3 中医药治疗与手术治疗、放射治疗、化学治疗联合作用15-17
• 3.3.1 中医药治疗与手术联合作用15-16
• 3.3.2 中医药治疗与放疗联合作用16
• 3.3.3 中医药治疗与化学治疗联合作用16-17
• 3.4 热疗与放射治疗、化学治疗、免疫治疗联合作用17-18
• 3.4.1 热疗与放疗联合作用17
• 3.4.2 热疗与化疗联合作用17
• 3.4.3 热疗与免疫治疗联合作用17-18
• 3.5 营养治疗和心理治疗在综合治疗中的作用18-19
• 3.5.1 营养治疗18
• 3.5.2 心理治疗18-19
• 4. 讨论19
• 5. 展望19-20
• 第二章 IFI16基因稳定表达抑制Hep-2细胞软琼脂集落形成20-33
• 1. 材料与方法20-27
• 1.1 材料20
• 1.1.1 主要仪器20
• 1.1.2 主要试剂20
• 1.2 方法20-27
• 1.2.1 Hep-2细胞总RNA的提取及其浓度测定20-21
• 1.2.2 Hep-2细胞总RNA的cDNA第一条链的合成21-22
• 1.2.3 IFI16基因编码区CDS的获得22
• 1.2.4 pUCm-IFI16重组质粒的BamH I酶切22
• 1.2.5 pEGFP-C1表达载体的BamH I酶切22-23
• 1.2.6 pEGFP-C1载体与IFI16基因片段的连接23
• 1.2.7 pEGFP-IFI16重组质粒的转化23-24
• 1.2.8 转化产物的扩大培养24
• 1.2.9 质粒DNA的提取24
• 1.2.10 pEGFP-IFI16重组质粒DNA的大提24-25
• 1.2.11 细胞转染25
• 1.2.12 细胞转染效率的检测25-26
• 1.2.13 筛选建立细胞系26-27
• 1.2.14 细胞集落形成试验27
• 1.2.15 凋亡检测27
• 2. 结果27-32
• 2.1 pEGFP-IFI16重组质粒的构建27-29
• 2.2 pEGFP-IFI16重组质粒在Hep-2细胞中的表达29-30
• 2.3 Hep-2/pEGFP-IFI16细胞系的建立30
• 2.4 IFI16基因稳定表达抑制Hep-2细胞集落形成30-31
• 2.5 IFI16基因稳定表达诱导Hep-2细胞发生凋亡31-32
• 3. 讨论32-33
• 第三章 姜黄素协同NF-κB抑制剂PDTC作用于Hep-2细胞33-39
• 1. 材料与方法34-35
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 主要仪器34
• 1.1.2 主要试剂34-35
• 1.2 方法35
• 1.2.1 细胞集落形成试验35
• 1.2.2 凋亡检测35
• 2. 结果35-37
• 2.1 Curcumin与PDTC协同作用抑制Hep-2细胞集落形成35-36
• 2.2 Curcumin与PDTC协同作用诱导Hep-2细胞发生凋亡36-37
• 3. 讨论37-39
• 参考文献39-44
• 致谢44-46
• 作者简历46-48

【参考文献】

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本文编号：653398