CDK4基因在鼻咽癌中的功能和分子机制的初步研究

发布时间：2017-08-12 08:36

  本文关键词：CDK4基因在鼻咽癌中的功能和分子机制的初步研究

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【摘要】：研究背景与目的鼻咽癌是中国南方和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一,具有明显的区域 分布特征。在临床上,鼻咽癌是具有特殊流行病学、临床特点、病理组织学特 点的头颈部恶性肿瘤。鼻咽癌的发生可能与基因易感性、环境危险因素、特定 饮食习惯和EB病毒感染及突变等因素有关。鼻咽癌的生成涉及多个基因和多 条信号通路改变,如Akt、细胞周期、Wnt通路及表皮生长因子受体信号通路等, 这些都促进了鼻咽癌的发生发展。因此,鼻咽癌相关重要基因及其介导的信号 通路研究将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理。我课题组主要参与利用多组含8000个基因的microarray比较了鼻咽癌组织 (鼻咽癌细胞含量占整个组织的70%以上)、混合的鼻咽癌细胞与鼻咽上皮组 织之间的基因表达谱。通过BRB软件分析,一共获得了435个上调基因和257 个下调基因。进一步,我们对这些差异表达基因在KEGG数据库进行了分析, 观察到了细胞周期信号通路在鼻咽癌中出现了明显的异常,这其中就涉及了细 胞周期依赖性激酶4(CDK4)的表达异常。CDK4是丝氨酸／苏氨酸激酶家族的成员,主要在肿瘤细胞核中表达,但并 非是一个转录因子。其常与周期蛋白D(cyclin D)结合形成复合物,通过调控RB 基因磷酸化水平的丢失,上调转录因子E2F1基因表达,从而参与细胞周期G1 向S期转化的调节,并导致肿瘤的发生。已有研究表明,相比于瘤基因CCND1, CDK4基因在小鼠恶性皮肤瘤发病过程中展示了更高的致瘤活性。此外,CDK4已经显示在多种肿瘤中高表达,这其中就包括了口腔鳞状细胞、胰腺癌和肺癌等。而在鼻咽癌中,我们也发现了CDK4异常的高表达。以上研究提示了CDK4在起始肿瘤发生发展过程中发挥了重要的作用。 microRNA (miRNA)是近年来发现生物体内源性的,长度约为20-23个核苷酸的非编码小RNA,能通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。很多证据直接表明,miRNA通过调控靶标基因的表达,参与肿瘤细胞的游走、侵袭和转移过程。如：过表达的MicroRNA-21能直接靶击下调MARCKS、PDCD4和PTEN蛋白表达从而影响前列腺癌、人胶质瘤、大肠癌和肝癌的游走、侵袭和转移。过表达的miR-182通过直接抑制小眼畸形相关转录因子M和FOXO3蛋白表达促进黑色素瘤细胞的游走和存活。CDK4在鼻咽癌中调控哪些miRNA表达?这些miRNA是对鼻咽癌细胞的生物学行为有何影响呢?而这些miRNA又在鼻咽癌中是否反过来调控CDK4介导的细胞周期信号通路?这些都是值得我们深入研究的问题。 基于CDK4在鼻咽癌中的研究现状,本课题的研究目的为明确CDK4基因在鼻咽癌中的功能,探讨其与miRNA的关系及参与的信号转导通路,为鼻咽癌发生发展的分子机制研究提供新思路。 研究内容与方法 1.CDK4基因在鼻咽癌组织和细胞中的表达水平检测：包括免疫组化和荧光定量PCR检测CDK4表达水平。 2.沉默CDK4基因对鼻咽癌细胞生物学行为的影响及机制研究 (1)构建靶向抑制CDK4的shRNA慢病毒干扰载体,利用MTT法、Transwell小室迁移实验及流式细胞仪检测细胞周期等观察CDK4表达抑制后细胞生长、迁移能力、细胞周期的变化,进一步确定CDK4基因在鼻咽癌细胞中的功能。 (2)Western blot检测细胞周期相关基因CDK6、CCND1、P21及E2F1的表达。 3.干扰CDK4后进行miRNA芯片表达谱分析及目标miRNA的功能、机制验证 (1)应用miRNAs表达谱芯片筛选干扰CDK4后差异表达miRNA,荧光定量PCR进一步验证这些miRNA。 (2)选取表达差异显著的Let-7c做为下一步研究对象, 使用Let-7c mimics/inhibitor转染细胞后,利用MTT法、Transwell小室迁移实验及Boyden小室侵袭实验等观察Let-7c mimics/inhibitor在细胞生长、迁移及侵袭能力的变化,进一步确定Let-7c在鼻咽癌细胞中的功能。 (3)利用siRNA靶向沉默E2F1,荧光定量PCR检测Let-7c表达变化。 (4) western blot检测Let-7c mimics/inhibitor转染细胞后CDK4、CCND1、P15、 P16、P21及E2F1、c-myc表达的变化。 结果 1. CDK4基因在鼻咽癌组织和细胞中的表达水平检测 免疫组化结果显示,CDK4在大部分鼻咽上皮组织中呈低表达在鼻咽癌组织中有不同程度的表达,但以高表达为主,差异有统计学意义(x2=10.997,P0.001)。选取8例鼻咽癌组织和8例鼻咽上皮组织进一步用荧光定量PCR验证CDK4表达情况,CDK4在鼻咽癌组织中的表达高于鼻咽上皮组织,结果显示差异具有统计学意义(t=-3.483,P=0.003)。荧光定量PCR显示,CDK4在8种鼻咽癌细胞SUNE1、5-8F、6-10B、CNE2、CNE1、HNE1、C6661、HONE1中mRNA水平表达较高,差异有统计学意义(F=26.745,P0.001),其中5-8F和6-10B表达最高,可作为下一步实验对象。 2.沉默CDK4基因对鼻咽癌细胞生物学行为的影响 建立慢病毒干扰载体和阴性对照载体,包装慢病毒后感染5-8F细胞,由于感染效率达到90%以上,western blot检测干扰后CDK4蛋白的表达明显下降,可直接用于后续实验。阳性干扰多克隆命名为C1-6、D2-4,阴性对照多克隆为MOCK。 1)MTT法检测细胞增殖情况,与空载对照细胞MOCK相比,干扰多克隆细胞C1-6、D2-4生长速度明显减慢,差异有统计学意义(F=38.163P0.001)。 2)Transwell小室迁移实验,细胞培养12h后C1-6、D2-4穿过聚碳酸酯膜的数量多于MOCK(F=38.629,P0.001)。提示干扰CDK4后,细胞运动能力减弱。 3)流式细胞仪检测细胞周期,C1-6、D2-4,与空载细胞相比,前者在G1期比例增高,差异有统计学意义(F=6.163,P=0.027),提示CDK4表达抑制组明显出现了细胞由G1向S期的转化障碍,细胞阻滞在G1期。 4)采用western blot检测了干扰CDK4后细胞周期相关基因CDK6、CCND1、P21及E2F1的表达,结果显示CCND1、CDK6、E2F1表达下调,P21表达上调。 3.干扰CDK4后miRNA芯片表达谱分析及功能、机制验证 1)干扰CDK4后的miRNA表达谱芯片研究,并利用BRB软件分析,最后共得到35个差异的miRNAs基因,差异的倍数变动在1.95-19.25之间不等,而且这35个miRNAs基因都展示一致上调。荧光定量PCR显示,Let-7c表达差异显著,选取Let-7c做为下一步研究对象。 2)靶向沉默E2F1后Let-7c的表达明显上调(5-8G：t=-36.565,P0.001；6-10B：t=-34.738,P0.001)。 3)使用Let-7c mimics/inhibitor转染细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,与空载对照细胞mimics Ctr/inhibitor Ctr相比,Let-7c mimics组细胞生长速度明显减慢,Let-7c inhibitor组细胞生长速度明显加快,差异有统计学意义(Mimics F=25.486, P=0.021, Inhibitor F=43.894,P0.001)。 4)Transwell小室迁移实验,细胞培养12h后以,对照组相比,L--7c mimics组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量减少,Let-7c inhibitor组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量增加,差异有统计学意义(Mimics t=7.572,P0.001,Inhibitort=5.494,P0.001)。提示过表达Let-7c后,细胞迁移能力减弱,干扰Let-7c后,细胞迁移能力增强。 5)Boyden小室侵袭实验,细胞培养12h后以,对照组相比,Let-7c mimics组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量减少,Let-7c inhibitor组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量增加,差异有统计学意义(Mimics t=6.147, P＜0.001, Inhibitort=5.741,P0.001)。提示过表达Let-7c后,细胞侵袭能力减弱,干扰Let-7c表达后,细胞侵袭能力增强。 6)采用western blot检测Let-7c mimics/inhibitor转染细胞后细胞周期基因CDK4、P15、P16、P21、及E2F1、c-myc表达的变化,结果显示Let-7c mimics转染细胞后,CDK4、E2F1、c-myc表达下调,P15、P16、P21表达上调,反之亦然。 结论 1.干扰CDK4后,鼻咽癌细胞的增殖、运动能力显著降低,提示CDK4在鼻咽癌中是一个肿瘤促进相关基因。 2.干扰CDK4后可能抑制细胞周期信号通路,通过抑制CCND1、CDK6及上调P21的表达参与细胞周期的调控；CDK4通过转录因子E2F1调节Let-7c的表达。 3.过表达Let-7c后,鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著降低,提示Let-7c在鼻咽癌中发挥了抑瘤的功能。其可能通过p15/p16/CDK4/E2F1信号通路发挥其抑瘤功能。
【关键词】：CDK4 鼻咽癌 miRNA 细胞周期
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 技术路线20-21
• 第一章 CDK4在鼻咽癌组织及细胞中的表达特性鉴定21-31
• 一 材料与方法21-25
• 二 结果25-29
• 三 讨论29-30
• 参考文献30-31
• 第二章 沉默CDK4对鼻咽癌细胞生物学行为的影响31-43
• 一 材料和方法31-36
• 二 结果36-41
• 三 讨论41-43
• 第三章 沉默CDK4基因后miRNA芯片表达谱分析及目标miRNA的功能验证43-64
• 一 材料和方法43-52
• 二 结果52-59
• 三 讨论59-61
• 参考文献61-64
• 全文小结64-66
• 中英文缩略词66-67
• 致谢67-68

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本文编号：660716