PON1化学发光底物的合成、性质及应用研究

发布时间：2017-03-27 09:10

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【摘要】：对氧磷酶(PON)属于芳香酯酶。芳香酯酶的活性与人的多种发病相关,在医学上,是肿瘤、心血管病、肝脏等疾病的病变指标之一,因而探测芳香酯酶的活性并研究PON1底物,对于疾病的早期诊断、及时预警有非常重要的临床意义。吖啶酯是一类较为常见的化学发光试剂,并且可以作为PON1的底物来测定PON1酶的活性,因此本课题合成四种新型吖啶酯,作为底物来考察其发光性能,评价底物的选择性,并用吖啶酯作为底物建立化学发光法,筛选能够激动PON1酶的中药有效成分。通过对9-(4-对氯苯氧羰基)-10-甲基吖啶三氟甲基磺酸盐(化合物1)的结构修饰研究,合成了9-(对叔丁基苯氧羰基)-10-甲基吖啶三氟甲基磺酸盐(化合物2)、9-苯氧羰基-10-甲基吖啶三氟甲基磺酸盐(化合物3)、9-(4-甲基苯氧羰基)-10-甲基吖啶三氟甲基磺酸盐(化合物4)、9-(2,4-二甲基苯氧羰基)-10-甲基吖啶三氟甲基磺酸盐(化合物5)等四种高量子产率的新型吖啶酯。其中化合物5整个化学发光反应在4s内完成,其他的四种吖啶化合物整个化学发光反应在0.8s内完成;五种吖啶酯化学发光效率大小如下:35421,苯环上没有取代基的吖啶酯具有更高的化学发光效率,而苯环上的对位被取代的吖啶酯的化学发光效率是有所降低。五种吖啶酯浓度均为4.02×10-11 mol·L-1,缓冲液(Tris-HCl)p H 7.5时22min内表现出了良好的自身稳定性;五种吖啶酯以乙腈作为溶剂,配成浓度为1.25×10-5mol·L-1母液液在4°C的冰箱里保存12周后,它们有不同程度的水解,浓度为1.25×10-5 mol·L-1的一级储备液的稳定性顺序为52431,其中化合物5自身稳定性最好,而化合物1的自身稳定性最差。以五种吖啶酯作为化学发光底物,考察了rh PON1和人体血清PON1对底物的催化水解曲线,它们的速率常数大小顺序均为13425,rh PON1和人体血清PON1催化水解吖啶酯的速率常数顺序一致;其中化合物5表现出了最好的稳定性,化合物5酚环上具有两个甲基,增加了化合物的空间位阻,从而增强了化合物的稳定性。以五种吖啶酯作为化学发光底物,考察了酯酶D和脂肪酶对对人体血清PON1催化水解吖啶酯底物的干扰作用,其中酯酶D和脂肪酶的浓度rh PON1浓度大于300倍,从结果可知,rh PON1,脂肪酶和酯酶D催化水解五种吖啶酯的能力相似。这表明,酯酶D和脂肪酶跟rh PON1相比对吖啶酯底物具有较差的催化水解活性。Na+和Ca2+PON1是激动剂,它们提高了底物的特异性和灵敏度。EDTA作为PON1抑制剂来抑制血清中PON1的特异活性,其中化合物5的特异性为最佳。运用以9-4-甲基苯氧羰基-10-甲基吖啶三氟甲基磺酸盐作为底物的化学发光法测定生姜丹参、川芎、三七、人参和川芎六种中药不同溶剂提取物对血清PON1的活性影响。初步结果表明:生姜、人参和三七对血清PON1有激动作用;川芎由于本身具有发光的性质,对测定有较大的干扰,当浓度调到很低时,它对血清PON1没有显示激动作用;虎杖由于自身存在能水解吖啶酯的成分而无法用化学发光法筛选,丹参对血清PON1几乎没有作用。
【关键词】：PON1 吖啶酯 合成 化学发光 筛选 中药 激动
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 1 绪论10-19
• 1.1 对氧磷酶（PON）10-12
• 1.1.1 PON简介10-11
• 1.1.2 PON1 与疾病的关系11-12
• 1.1.3 PON1 活性影响因素12
• 1.2 PON1 水解底物及底物的检测方法12-15
• 1.2.1 羧酸酯类底物12-14
• 1.2.2 机磷酸酯类底物14-15
• 1.3 化学发光15-17
• 1.3.1 化学发光的原理15
• 1.3.2 化学发光试剂15-16
• 1.3.3 化学发光分析法简介16
• 1.3.4 吖啶酯衍生物的化学发光体系16-17
• 1.4 吖啶酯衍生物的化学发光机理及吖啶酯测定酶活性原理17-18
• 1.5 本课题研究意义18-19
• 2 PON1 化学发光底物的合成19-26
• 2.1 引言19
• 2.2 PON1 吖啶类底物的合成方法和合成路线19-20
• 2.3 实验仪器与试剂20
• 2.4 实验内容20-23
• 2.4.1 化合物 9-（对叔丁基苯氧羰基）10甲基吖啶三氟甲基磺酸盐的合成20-21
• 2.4.2 化合物 9-苯氧羰基10甲基吖啶三氟甲基磺酸盐的合成21-22
• 2.4.3 化合物 9-（4-对甲基苯氧羰基）10甲基吖啶三氟甲基磺酸盐的合成22-23
• 2.4.4 化合物 9-（2，，4-二甲基苯氧羰基）10甲基吖啶三氟甲基磺酸盐的合成23
• 2.5 结果与讨论23-25
• 2.6 本章小结25-26
• 3 PON1 化学发光底物的性能测试26-47
• 3.1 引言26-27
• 3.2 实验部分27-29
• 3.2.1 仪器和试剂27
• 3.2.2 储备液的配制27-28
• 3.2.3 实验方法28-29
• 3.3 结果和讨论29-45
• 3.3.1 五种吖啶酯的化学发光时间29-30
• 3.3.2 五种吖啶酯化学发光工作曲线30-31
• 3.3.3 五种吖啶酯自身稳定性考察31-33
• 3.3.4 标准重组人体对氧磷酶（rhPON1）催化五种吖啶酯的反应动力学曲线33-34
• 3.3.5 人体血清PON1 催化五种吖啶酯的反应动力学曲线34-35
• 3.3.6 脂肪酶和酯酶D的干扰试验35-38
• 3.3.7 考察Na+对rhPON1、人体血清PON1 和脂肪酶的作用38-43
• 3.3.8 添加PON1 抑制剂ETDA考察rhPON1 和人体血清PON1 的特异性43-45
• 3.4 本章小结45-47
• 4 化学发光法从中药中快速筛选PON1 激动剂47-57
• 4.1 引言47
• 4.2 材料与试剂47-48
• 4.2.1 材料47-48
• 4.2.2 仪器与试剂48
• 4.3 实验方法48-51
• 4.3.1 化学发光法48
• 4.3.2 中药材的提取与分离方法48-50
• 4.3.3 分离纯化生姜醇提液50-51
• 4.4 实验结果与讨论51-56
• 4.4.1 六种中药材提取物对血清PON1 的影响51-52
• 4.4.2 生姜不同溶剂提取物对rhPON1 和血清PON1 的影响52-53
• 4.4.3 不同浓度生姜提取物对血清PON1 活性的影响53-54
• 4.4.4 生姜分离产物 3#对血清 PON1 活性的影响54-56
• 4.5 本章小结56-57
• 5 结论与展望57-59
• 5.1 结论57-58
• 5.2 展望58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-70
• 附录70-75
• A 作者硕士研究生期间科研成果70
• B 化合物的1HNMR谱图70-75

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