人二氢乳清酸脱氢酶抑制剂的筛选及复合物晶体结构研究

发布时间：2017-03-27 16:09

  本文关键词：人二氢乳清酸脱氢酶抑制剂的筛选及复合物晶体结构研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和器官移植排异反应等自身免疫性疾病严重影响人们的日常生活。目前,临床上常用的免疫抑制剂有糖皮质激素、微生物代谢产物、抗代谢物和烷化剂等药物,但许多免疫抑制剂都因不同程度的副作用从而限制其临床上的应用,因此开发高效、低毒、靶向性的小分子抑制剂是当前自身免疫性疾病治疗的难点和热点。二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)是嘧啶从头合成的一个关键酶,通过抑制DHODH来抑制嘧啶合成,可使DNA和RNA合成受阻,阻碍淋巴细胞分化增殖,从而通过抑制免疫反应来达到治疗某些自身免疫性疾病的目的。目前临床上以人二氢乳清酸脱氢酶(hDHODH)为药物治疗靶标的代表药物是来氟米特,但长期服用来氟米特会产生头痛、恶心和皮疹等副作用,因此,我们希望以hDHODH为靶标开发出副作用少、高效且结构新颖的hDHODH抑制剂用于自身免疫性疫病治疗的侯选药物。本论文首先通过虚拟筛选得到hDHODH的先导抑制剂b1,其针对hDHODH酶水平的半数有效抑制浓度(IC50值)为0.365μM；进而培养化合物b1与hDHODH的复合物晶体,获得其复合物晶体结构(PDB ID为4LS0)；基于该先导化合物b1与hDHODH的复合物晶体结构,对其亲水部分和疏水部分分别进行结构改造,经过几轮的优化,我们设计合成了25个先导化合物的衍生物；对所有化合物进行酶水平的活性评价,最终我们得到两个纳摩尔级的抑制剂,分别是化合物b13和b24。其中,化合物b13的IC50值为32 nM,化合物b24的IC50值为43 nM,其酶水平抑制活性较先导化合物提高了10余倍,证明我们的改造思路是合理的；随后我们选择化合物b13和b21做了复合物晶体结构研究,其PDB ID分别为4LS1和4LS2。在我们解析的三个复合物晶体结构中,每个抑制剂与酶的结合均有水分子参与介导相互作用,通过形成氢键网络,水分子成为抑制剂与氨基酸之间相互作用的桥梁,从而增强抑制剂与酶的结合能力。上述结果说明水分子参与的介导作用在抑制剂与酶的结合中是及其重要的,因此在以后hDHODH的抑制剂设计中,我们可以充分考虑水分子介导的相互作用,从而设计出更优的抑制剂。综上所述,本论文基于先导化合物的复合物晶体结构,指导抑制剂的结构优化和改造,改造后的化合物b13和b24较先导化合物b1的酶水平抑制活性提高了10余倍；通过分析本论文中解析的三个复合物晶体结构,阐明了水分子介导的氢键网络相互作用在药物设计中的重要性。
【关键词】：自身免疫性疾病 人二氢乳清酸脱氢酶 酶水平活性评价 复合物晶体结构 抑制剂
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第1章 人二氢乳清酸脱氢酶抑制剂的研究进展9-22
• 1.1 引言9-11
• 1.2 hDHODH抑制剂研究进展11-21
• 1.3 选题意义及课题目标21-22
• 第2章 人二氢乳清酸脱氢酶抑制剂的筛选22-39
• 2.1 引言22-23
• 2.2 材料和方法23-32
• 2.2.1 材料23-28
• 2.2.1.1 质粒和菌株23
• 2.2.1.2 实验试剂23-25
• 2.2.1.3 实验仪器25-26
• 2.2.1.4 常用实验试剂配制方法26-28
• 2.2.2 实验方法28-32
• 2.2.2.1 质粒构建28
• 2.2.2.2 蛋白表达28-29
• 2.2.2.3 蛋白纯化29-31
• 2.2.2.4 蛋白定量31-32
• 2.2.2.5 体外活性测试32
• 2.3 实验结果与讨论32-38
• 2.3.1 hDHODH表达与纯化32-33
• 2.3.2 体外活性测试33-38
• 2.4 本章小结38-39
• 第3章 人二氢乳清酸脱氢酶抑制剂的复合物晶体结构研究39-52
• 3.1 引言39-41
• 3.2 材料和方法41-42
• 3.2.1 材料41-42
• 3.2.2 实验方法42
• 3.2.2.1 质粒构建、蛋白表达、纯化42
• 3.2.2.2 晶体培养与收集42
• 3.2.2.3 数据解析与精修42
• 3.3 结果与讨论42-51
• 3.3.1 单晶培养42-43
• 3.3.2 数据收集与处理43-44
• 3.3.3 结构解析与精修44-47
• 3.3.3.1 电子云密度图分析44
• 3.3.3.2 拉氏图分析44-46
• 3.3.3.3 精修结果46-47
• 3.3.4 晶体结构47-51
• 3.3.4.1 抑制剂的结合模式47-48
• 3.3.4.2 抑制剂与蛋白质的相互作用48-51
• 3.4 本章小结51-52
• 第4章 全文总结52-53
• 参考文献53-65
• 硕士期间发表论文65-66
• 致谢66

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本文编号：270640