TSA对内质网应激诱导线粒体损伤的影响及其机制

发布时间：2017-03-31 14:13

  本文关键词：TSA对内质网应激诱导线粒体损伤的影响及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：内质网（Endoplasmic reticulum, ER）是真核细胞中一种重要的多功能膜性结构细胞器，在受到外界条件的刺激下产生内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS），ERS时会适应性地激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)以协助细胞的自身修复。然而，长时间的应激则最终会导致细胞凋亡。在内质网应激诱导的细胞凋亡中，线粒体的改变也扮演着重要角色，即线粒体与内质网应激细胞的凋亡之间存在密切关系。 毒胡萝卜素（Thapsigargin, TG）是一种常用的内质网应激诱导剂，能特异性地抑制内质网Ca2+-ATPases（SERCA）扰乱细胞的Ca2+稳态，诱导细胞凋亡。在内质网应激时，葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein78, GRP78)是细胞内最先感受应激并激活UPR反应的蛋白。它最初被人们认为是一种存在于内质网中的蛋白，然而最近的研究发现，GRP78可以在不同种类的细胞中定位于线粒体等多种细胞器，并在不同条件下发挥着不同的生物学功能。如文献报道，小鼠脑肿瘤9L细胞在内质网应激条件下，GRP78会从内质网移位至线粒体，但其是否参与对应激细胞线粒体的保护并未进一步阐明。 线粒体是细胞中重要的能量代谢场所，由内外两层膜构成，通过三羧酸循环为细胞提供能量，维持细胞的正常生理功能。目前，对于ERS时细胞所执行的与凋亡相关的分子机制已得到了十分广泛的研究，但是在内质网应激条件下，探究线粒体功能损伤的相关报道还不多见。 曲古菌素A（TrichostatinA, TSA）是一种广谱的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以通过抑制ERS细胞中的去乙酰化酶活性，调节应激细胞的乙酰化水平而调控相关基因的转录，保护应激细胞。已有研究表明，TSA在内质网应激时通过升高蛋白GRP78、Bcl-2，降低CHOP的表达，起到对心肌细胞的保护作用。 由此可知，TSA可以保护内质网应激细胞，而内质网又与线粒体在功能上密切相关，所以我们猜想，TSA在保护内质网应激细胞时，可能会通过与线粒体相关的途径，减少细胞凋亡。 实验目的： 本实验拟探究在TG诱导ERS条件下，TSA对H9c2细胞与线粒体相关的保护机制。 实验方法: 本实验以H9c2细胞为研究对象，通过CCK-8实验检测内质网应激诱导剂TG在不同剂量浓度下对H9c2细胞存活率的影响，并根据GRP78在不同时间的表达确定合理的应激诱导剂给药时间；采用流式细胞术，检测TSA在确定的浓度和时间条件下对内质网应激诱导的细胞凋亡的保护作用；采用JC-1染色法，并分别用荧光显微镜观察和流式细胞术定量，观察TSA对内质网应激诱导的线粒体膜电势降低的抑制作用；采用Western-blot法检测与线粒体损伤相关指标CytC的表达改变；采用免疫荧光及Western-blot技术，检测TSA对TG诱导的内质网应激细胞中GRP78的表达改变；采取免疫荧光与细胞器染色方法，检测GRP78蛋白在线粒体中的定位；采用亚细胞结构分离法，利用Western定量检测定位于线粒体中的GRP78。 实验结果： （1）TG工作浓度的确定：采用CCK-8法，TG对细胞的存活率呈剂量依赖性，其中1μM组存活率为：（88.31±3.60）%；2μM组的存活率为：（87.66±2.60）%，4μM组存活率为：（58.21±3.15）%，与对照组（98.23±2.1）%相比存在显著性差异（P＜0.01），8μM组存活率为：（31.53±2.14）%，10μM组存活率为：（14.68±3.39）%，为进一步探究合理浓度，我们采取小浓度范围，其中3μM组存活率为：（59.26±3.94）%，与对照组相比有显著性差异（P＜0.01），所以我们接下来采用3μM为工作浓度。 （2）TG工作时间的确定：采用Western-blot检测法，TG作用于细胞的时程变化中，0h、2h、4h三个时间点，GRP78的表达均无明显变化，8h时为GRP78蛋白表达第一次显著性升高，与对照组（97.22±2.91）%相比有显著性差异（P＜0.05），而12小时与8小时差异不大，24h进一步显著升高，所以我们采用8h为后续的工作时间。 （3）TSA对TG诱导的细胞凋亡的影响：采用流式细胞术观察，其中TSA与TG合用组的细胞凋亡率为：(23.33±1.44)%，与TG组（39.23±0.42）%相比，具有显著性差异（P＜0.05）。 （4）TSA对TG诱导线粒体膜电势降低的作用：采用JC-1染色法并以荧光显微镜及流式检测结果观察发现，TSA可以抑制由TG诱导的线粒体膜电势降低。流式细胞术结果表明，与单独给予TG（37.32±0.35）组相比，TG与TSA合用组（15.76±0.28）能显著抑制线粒体膜电势的降低（P＜0.05）。 （5）TSA对TG诱导的CytC表达的影响：采用Western-blot法，与TG组相比，TSA与TG合用组会显著降低应激细胞中CytC的表达的升高（P＜0.05）。 （6）TSA对内质网应激细胞GRP78表达的影响：采用免疫荧光法和Western-blot法，其中与TG组相比，TSA与TG合用组能显著升高细胞中GRP78的表达（P＜0.01）。 （7）TSA对GRP78在内质网与线粒体中分布的影响：采用荧光染色法及亚细胞结构分离法定性并定量观察，TSA与TG的合用能显著增加定位于线粒体上的GRP78。 实验结论： （1）TSA能抑制由TG诱导的内质网应激下H9c2细胞凋亡； （2）TSA能通过抑制线粒体膜电势降低、降低CytC表达干预内质网应激条件下的线粒体损伤； （3）TSA可能由于增加内质网应激下定位于线粒体的GRP78参与对线粒体损伤的保护。
【关键词】：GRP78 内质网应激 线粒体 TSA
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 第1章 文献综述15-26
• 1.1 内质网应激15-17
• 1.1.1 内质网功能15
• 1.1.2 内质网应激15-16
• 1.1.3 未折叠蛋白反应与其相关信号机制16-17
• 1.2 线粒体17-20
• 1.2.1 线粒体结构17
• 1.2.2 线粒体功能17-18
• 1.2.3 线粒体与细胞凋亡18-19
• 1.2.4 线粒体膜电势19
• 1.2.5 细胞色素 C19-20
• 1.3 GRP7820-21
• 1.3.1 GRP78 的细胞内定位及相应功能20-21
• 1.4 内质网与线粒体的 Cross-talk21-23
• 1.5 组蛋白乙酰化修饰与真核生物基因表达调控23-26
• 1.5.1 组蛋白修饰23-25
• 1.5.2 曲古菌素 A25-26
• 第2章 实验材料与方法26-38
• 2.1 实验用细胞株26
• 2.2 主要仪器设备26-27
• 2.3 主要试剂27-28
• 2.4 主要试剂的配制28-31
• 2.5 H9c2 细胞的培养31-32
• 2.6 CCK-8 检测法32-33
• 2.7 Flow CytoMetry 检测法33
• 2.8 Western Blot 检测法33-35
• 2.9 免疫荧光染色法35-36
• 2.10 细胞器探针与免疫荧光染色法36-37
• 2.11 JC-1 荧光染色法37
• 2.12 亚细胞结构分离法37
• 2.14 统计学分析37-38
• 第3章 实验结果38-50
• 3.1 TSA 对 TG 诱导内质网应激细胞的保护作用38-42
• 3.1.1 TG 作用浓度的确定38-39
• 3.1.2 TG 作用时间的确定39-40
• 3.1.3 TSA 对 TG 诱导细胞凋亡的影响40-42
• 3.2 TSA 对 TG 诱导线粒体损伤的影响42-45
• 3.2.1 TSA 对 TG 诱导线粒体膜电势降低的作用42-44
• 3.2.2 TSA 对 TG 诱导的 CytC 表达的影响44-45
• 3.3 TSA 对内质网应激细胞 GRP78 表达与分布的影响45-50
• 3.3.1 TSA 对内质网应激细胞 GRP78 表达的影响45-46
• 3.3.2 TSA 对内质网与线粒体中 GRP78 的影响定性观察46-48
• 3.3.3 TSA 对 TG 诱导线粒体中 GRP78 的影响定量观察48-50
• 第4章 讨论50-53
• 第5章 结论53-54
• 参考文献54-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 关丽英;许彩民;潘华珍;;内质网应激介导的细胞凋亡[J];生物化学与生物物理进展;2007年11期

2 门秀丽;张丽萍;吴静;刘虹麟;张文健;娄晋宁;;线粒体形态与细胞凋亡的关系[J];生理科学进展;2012年05期

3 Thekkuttuparambil Ananthanarayanan Ajith;Thankamani Gopinathan Jayakumar;;Mitochondria-targeted agents: Future perspectives of mitochondrial pharmaceutics in cardiovascular diseases[J];World Journal of Cardiology;2014年10期

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本文编号：279708