群感效应对红曲霉洛伐他汀和红曲色素合成的影响及调控机制研究

发布时间：2017-04-14 12:05

  本文关键词：群感效应对红曲霉洛伐他汀和红曲色素合成的影响及调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的最近的研究表明一种被称为群感效应现象在提高微生物次生代谢产物量方面具有较大的应用前景。本研究中,我们探讨亚油酸作为群感效应信号分子氧脂素的前体对人红曲霉洛伐他汀和红色素的合成影响及其调控机理。方法分别采用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测洛伐他汀和红色素的产量,探讨亚油酸对红色素和洛伐他汀合成浓度-时间-产量关系;通过Real-Time PCR法检测亚油酸对红曲霉洛伐他汀合成调控基因mk H和洛伐他汀合成基因mk A浓度-时间-表达量的关系;酶联免疫吸附法及比色法分别检测亚油酸对红曲霉G蛋白偶联信号通路中环腺苷酸和胞内钙离子浓度-时间-含量的关系;非放射性蛋白激酶检测法检测蛋白激酶A、蛋白激酶C和酶联免疫法检测磷脂酶C浓度-时间-活性的关系。结果亚油酸对红曲霉次级代谢产物红曲色素和洛伐他汀的产量均有较高的影响,并且呈一定的浓度依赖性。高浓度的亚油酸不利于色素的产生,较低浓度的亚油酸有利于红曲色素的产生。亚油酸浓度为64μM的实验组得到较高的红曲色素产量,在第十三天产量达5.6U/m L,相比对照组增长了27%;较高浓度的亚油酸有利于洛伐他汀的产生,512μM浓度的亚油酸实验组获得较高的洛伐他汀的产量,在第十三天产量达13.2mg/g,与对照组相比增长了26%。Real-Time PCR的结果表明较高浓度亚油酸可提高mk A基因的转录表达水平,而在低浓度亚油酸中mk A基因的表达受到抑制。mk A基因最高的表达出现在512μM组的第九天,表达差异相比对照组达5.36倍;mk A基因最低表达出现在64μM组的第七天,只是对照组的0.27倍。在全部的亚油酸添加组中,调控基因mk H在培养前中期有不同程度的较高水平的表达,最大的差异出现在第九天,分别是64μM组的11.8倍和512μM的7.41。亚油酸可起引c AMP-PKA途径中c AMP浓度的的增加,并且c AMP浓度维持在较高水平,呈一定的浓度依赖性,而PKA的活性也有显著的升高,PKA的活性同样维持在较高水平,活性高低呈亚油酸浓度依赖性的升高,这与c AMP的变化相一致;磷脂酰肌醇信号通路中PKC的活性有一定的升高,而胞内钙离子浓度和磷脂酶C活性相比对照组没有显著的变化。结论外源添加亚油酸可改变红曲霉产生色素的过程;在一定范围内,色素的产量与亚油酸添加浓度成反比,洛伐他汀的产量与亚油酸添加浓度成正比,洛伐他汀和色素的产量成一定的竞争性。洛伐他汀合成基因mk A的转录水平的变化与洛伐他汀的合成量呈正比性相关,而与色素产量是一定的反相关性;调控基因mk H的表达与洛伐他汀和色素的合成量相关,调控基因mk H的表达水平越高,红曲霉次生代谢越活跃。亚油酸对红曲霉的洛伐他汀和红色素合成受c AMP/PKA信号途径影响较大,磷脂酰肌醇-PKC则有一定的影响,而磷脂酰肌醇-Ca2+信号途径的则无显著影响。
【关键词】：洛伐他汀 群感效应 G蛋白信号通路 调控 红曲霉
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-22
• 1 文献综述13-22
• 1.1 红曲霉及其次级代谢产物的研究进展13-18
• 1.2 群感效应现象的研究18-22
• 第一部分 亚油酸对红曲霉洛伐他汀和色素产量的影响22-30
• 1 材料和仪器22-23
• 1.1 菌株22
• 1.2 试剂22
• 1.3 主要设备22-23
• 2 方法23-25
• 2.1 红曲霉的培养23-24
• 2.2 红曲霉发酵液中洛伐他汀及色素的产生曲线24
• 2.3 菌体干重的测定方法24
• 2.4 数据统计与处理24-25
• 3 实验结果25-28
• 3.1 亚油酸对红曲霉的红曲色素产生的影响25-27
• 3.2 亚油酸对红曲霉的洛伐他汀产生的影响27-28
• 4 讨论28-30
• 第二部分 红曲霉群感效应调控机理的探究30-52
• 1 材料30-31
• 1.1 试剂30-31
• 1.2 主要设备31
• 2 方法31-40
• 2.1 引物的设计31-32
• 2.2 RT-PCR32-35
• 2.3 Real-Time PCR35-36
• 2.4 总蛋白浓度的检测36-37
• 2.5 胞内c AMP含量的检测37-38
• 2.6 蛋白激酶A活性的检测38-39
• 2.7 蛋白激酶C活性的检测39
• 2.8 磷脂酶C活性的检测39
• 2.9 胞内Ca2+浓度的检测39-40
• 2.10 数据统计与处理40
• 3 实验结果40-50
• 3.1 mk A基因、mk H基因和内参β-actin基因PCR结果40-41
• 3.2 目标基因与内标基因的扩增效率一致性验证试验41-43
• 3.3 亚油酸对红曲霉mk H和mk A表达的影响43-45
• 3.4 亚油酸对红曲霉与G蛋白偶联受体介导的的c AMP信号途径和磷脂酰肌醇信号通路的影响45-50
• 4 讨论50-52
• 全文总结52-53
• 展望53-54
• 参考文献54-58
• 附录一 硕士期间发表的论文58-59
• 附录二 缩写词及中英文对照表59-60
• 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 高嘉安,郭东,王德辉,陈淑杰;产MonacolinK红曲霉菌的筛选及发酵条件的研究[J];吉林农业大学学报;1997年03期

2 Yaochen Li;Junping Lv;Chen Zhong;Wen Hao;Yaqin Wang;Jianrong Zhu;;Performance and role of N-acyl-homoserine lactone(AHL)-based quorum sensing(QS) in aerobic granules[J];Journal of Environmental Sciences;2014年08期

3 王金字;董文宾;杨春红;李娜;杨津;;红曲色素的研究及应用新进展[J];食品科技;2010年01期

4 韩梅，，李秉慧;红色红曲霉菌发酵提取液降胆固醇作用的研究[J];微生物学通报;1994年05期

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本文编号：305940