基于hCMEC/D 3 细胞单层膜作为血脑屏障模型的地西泮低氧转运研究
发布时间：2022-01-10 06:46
低氧作为多种中枢神经系统疾病所具有的特征状态,不仅跟创伤性脑损伤、阿尔兹海默病、脑缺血、中风有关,而且跟高原脑水肿、颅内感染、长期癫痫持续状态后窒息这些高原易发疾病也息息相关。低氧对中枢神经系统的影响尤为严重,因为脑细胞代谢旺盛、耗氧量较大,所以脑皮质对低浓度氧的耐受性较低。中枢神经系统疾病类药物递送至脑组织,主要通过血-脑屏障和血-脑脊液屏障。血-脑屏障通过脑微血管内皮细胞排除毒性物质和代谢产物,同时使脑组织摄取所需营养物质,因此血-脑屏障是保证脑组织内环境稳定的重要生理结构之一。然而大量实验数据证明,低氧可能会影响血脑屏障的结构,干扰其功能,进而影响药物进出脑组织,使患者产生各种不良反应。前期课题组的研究证明,低氧对大鼠血脑屏障中药物转运蛋白表达产生影响。但是先前的研究多采用大鼠脑组织,很难反映低氧对人血脑屏障中药物转运蛋白表达的差异性影响。因此,课题组依据相关文献,采用人脑微血管内皮细胞作为血脑屏障的代表性结构,设计了如下实验,旨在探讨低氧对血脑屏障中药物转运的影响。首先,研究了低氧对地西泮在hCMEC/D3单细胞层上转运的影响。结果显示:地西泮转运的时间依...
【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
血脑屏障结构示意图
兰州大学硕士学位论文基于hCMEC/D3细胞单层膜作为血脑屏障模型的地西泮低氧转运研究71.3技术路线本课题研究路线设计如图1-2所示：图1-2本课题技术路线1.4课题的创新性一、创新性地将低氧对中枢神经系统疾病的药物转运影响及低氧对血脑屏障的结构与药物通透性的影响联系起来。二、首次尝试构建人脑微血管内皮细胞单层膜的低氧模型，使药物地西泮在此构建的体外血脑屏障模型进行跨膜转运。三、本研究所采用的实验方法与分子生物学技术是国际上研究药物转运与调控机制的通用方法，紧跟国际同类研究的前沿。
兰州大学硕士学位论文基于hCMEC/D3细胞单层膜作为血脑屏障模型的地西泮低氧转运研究24们先通过Real-timePCR研究了P-gp的mRNA水平的变化。正如之前所预期的，P-gp的mRNA在低氧时表达降低。Control组、低氧24h组、低氧48h组和低氧72h组的hCMEC/D3细胞中药物转运蛋白mRNA表达水平测定结果如图3-1所示。结果显示，对于P-gp：低氧24h组与Control组相比，细胞中P-gpmRNA相对表达量下调了36.74%；低氧48h组与Control组相比，组织中P-gpmRNA相对表达量显著下调80.88%(P<0.01)；低氧72h组与Control组相比，组织中P-gpmRNA相对表达量下调了32.85%。证明低氧会在48h内对P-gp的mRNA表达引起显著性差异（图3）。图3-1低氧不同时间对P-gp的mRNA表达水平的影响注：**P＜0.01，与对照组相比有显著差异。3.3.2低氧对hCMEC/D3细胞膜中P-gp的蛋白表达水平的影响为了研究低氧(1%O2)暴露对hCMEC/D3细胞中P-gp蛋白稳定性的影响，我们选择免疫印迹研究了P-gp蛋白表达水平随时间的变化。通过WesternBlot实验来评估hCMEC/D3中ABC族药物转运蛋白P-gp的蛋白表达水平，P-gp可在170kDa处检测到特异性条带而ATP1A1作为膜蛋白内参在110kDa处检测到特异性条带。结果显示，低氧条件下P-gp的蛋白质表达与mRNA表达趋势相同（见图3-2）。对于P-gp：低氧24h组与Control组相比，细胞中P-gp蛋白相对表达量下调9.42%；低氧48h组与Control组相比，细胞中P-gp蛋白相对表达量显著下调19.33%(P<0.05)；低氧72h组与Control组相比，细胞中P-gp蛋白相对表达量下调了8.91%。有趣的是，P-gp的表达并没有持续下降，而是在72h呈上升趋势，这可能与细胞的代偿机制有关。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高原缺氧对药物转运体影响的研究进展[J]. 张明霞,王荣,李文斌,鹿辉,谢华,罗冰峰,王昌,刘晶晶,贾正平. 中国药理学通报. 2018(03)
[2]P-糖蛋白分子结构及转运机制[J]. 杨晓波,刘克辛. 药物评价研究. 2018(01)
[3]高原脑水肿病理生理机制的研究进展[J]. 李虎,王百忍,巩固. 中华神经外科疾病研究杂志. 2016(04)
[4]肿瘤多药耐药（MDR）和抗凋亡之间的关系[J]. 谢磊,黄钢. 复旦学报(医学版). 2012(04)
[5]七叶皂苷钠对低氧暴露下大鼠血-脑脊液屏障通透性变化的影响及其抗渗漏机制研究[J]. 郭平,周其全,罗涵,袁月,周波. 解放军医学杂志. 2012(02)
[6]脑缺血/再灌注损伤机制的研究现状[J]. 朱贤富,王振华. 医学综述. 2010(18)
[7]洛哌丁胺的不良反应与合理用药[J]. 赖根福,雷招宝. 药学与临床研究. 2009(04)
[8]缺氧状态下神经系统的改变和护理[J]. 姜北芳,刘威. 中国实用医药. 2008(35)
[9]地西泮,老药新用途[J]. 张西京,游思维. 中国处方药. 2005(09)
[10]氯硝安定注射液静滴治疗神经症副反应的观察及护理[J]. 胡慧芳,吴静娜,杜荣荣. 实用护理杂志. 2003(16)
本文编号：3580240
【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
血脑屏障结构示意图
兰州大学硕士学位论文基于hCMEC/D3细胞单层膜作为血脑屏障模型的地西泮低氧转运研究71.3技术路线本课题研究路线设计如图1-2所示：图1-2本课题技术路线1.4课题的创新性一、创新性地将低氧对中枢神经系统疾病的药物转运影响及低氧对血脑屏障的结构与药物通透性的影响联系起来。二、首次尝试构建人脑微血管内皮细胞单层膜的低氧模型，使药物地西泮在此构建的体外血脑屏障模型进行跨膜转运。三、本研究所采用的实验方法与分子生物学技术是国际上研究药物转运与调控机制的通用方法，紧跟国际同类研究的前沿。
兰州大学硕士学位论文基于hCMEC/D3细胞单层膜作为血脑屏障模型的地西泮低氧转运研究24们先通过Real-timePCR研究了P-gp的mRNA水平的变化。正如之前所预期的，P-gp的mRNA在低氧时表达降低。Control组、低氧24h组、低氧48h组和低氧72h组的hCMEC/D3细胞中药物转运蛋白mRNA表达水平测定结果如图3-1所示。结果显示，对于P-gp：低氧24h组与Control组相比，细胞中P-gpmRNA相对表达量下调了36.74%；低氧48h组与Control组相比，组织中P-gpmRNA相对表达量显著下调80.88%(P<0.01)；低氧72h组与Control组相比，组织中P-gpmRNA相对表达量下调了32.85%。证明低氧会在48h内对P-gp的mRNA表达引起显著性差异（图3）。图3-1低氧不同时间对P-gp的mRNA表达水平的影响注：**P＜0.01，与对照组相比有显著差异。3.3.2低氧对hCMEC/D3细胞膜中P-gp的蛋白表达水平的影响为了研究低氧(1%O2)暴露对hCMEC/D3细胞中P-gp蛋白稳定性的影响，我们选择免疫印迹研究了P-gp蛋白表达水平随时间的变化。通过WesternBlot实验来评估hCMEC/D3中ABC族药物转运蛋白P-gp的蛋白表达水平，P-gp可在170kDa处检测到特异性条带而ATP1A1作为膜蛋白内参在110kDa处检测到特异性条带。结果显示，低氧条件下P-gp的蛋白质表达与mRNA表达趋势相同（见图3-2）。对于P-gp：低氧24h组与Control组相比，细胞中P-gp蛋白相对表达量下调9.42%；低氧48h组与Control组相比，细胞中P-gp蛋白相对表达量显著下调19.33%(P<0.05)；低氧72h组与Control组相比，细胞中P-gp蛋白相对表达量下调了8.91%。有趣的是，P-gp的表达并没有持续下降，而是在72h呈上升趋势，这可能与细胞的代偿机制有关。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高原缺氧对药物转运体影响的研究进展[J]. 张明霞,王荣,李文斌,鹿辉,谢华,罗冰峰,王昌,刘晶晶,贾正平. 中国药理学通报. 2018(03)
[2]P-糖蛋白分子结构及转运机制[J]. 杨晓波,刘克辛. 药物评价研究. 2018(01)
[3]高原脑水肿病理生理机制的研究进展[J]. 李虎,王百忍,巩固. 中华神经外科疾病研究杂志. 2016(04)
[4]肿瘤多药耐药（MDR）和抗凋亡之间的关系[J]. 谢磊,黄钢. 复旦学报(医学版). 2012(04)
[5]七叶皂苷钠对低氧暴露下大鼠血-脑脊液屏障通透性变化的影响及其抗渗漏机制研究[J]. 郭平,周其全,罗涵,袁月,周波. 解放军医学杂志. 2012(02)
[6]脑缺血/再灌注损伤机制的研究现状[J]. 朱贤富,王振华. 医学综述. 2010(18)
[7]洛哌丁胺的不良反应与合理用药[J]. 赖根福,雷招宝. 药学与临床研究. 2009(04)
[8]缺氧状态下神经系统的改变和护理[J]. 姜北芳,刘威. 中国实用医药. 2008(35)
[9]地西泮,老药新用途[J]. 张西京,游思维. 中国处方药. 2005(09)
[10]氯硝安定注射液静滴治疗神经症副反应的观察及护理[J]. 胡慧芳,吴静娜,杜荣荣. 实用护理杂志. 2003(16)
本文编号：3580240
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