降糖多肽Brevinin-2GUb的高效表达及活性鉴定

发布时间：2023-02-18 21:16

　　为实现降糖多肽Brevinin-2GUb在大肠杆菌中的高效表达,本文将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的p ET32a载体中,将重组表达载体p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb转化至大肠杆菌中诱导表达Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白。通过对表达温度进行优化,结果显示16℃诱导表达20 h后融合蛋白产量达到36 mg/L;该融合蛋白经肠激酶(EK)特异性切割后成功获得不带标签的Brevinin-2GUb多肽,产量约为2.50 mg/L,纯度达90%以上。通过反相高效液相色谱对重组表达的Brevinin-2GUb进行鉴定,结果显示重组表达的Brevinin-2GUb与人工合成的Brevinin-2GUb的氨基酸序列一致。通过血平板检测发现,170μg/m L的重组表达Brevinin-2GUb多肽无溶血效应。此外,重组表达的Brevinin-2GUb多肽在浓度为10μg/m L时对INS-1细胞产生显著的刺激胰岛素分泌作用(为基础释放量的120.04%;p<0.01)。研究结果为Brev...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株与质粒
        1.1.2 试剂
        1.1.3 多肽
    1.2 方法
        1.2.1 构建重组质粒p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb
            1.2.1. 1 Brevinin-2GUb基因的扩增
            1.2.1. 2 RF线性扩增反应构建重组质粒p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb
        1.2.2 融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb在大肠杆菌BL21(DE3）中的小量表达及表达温度优化
        1.2.3 融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb在大肠杆菌BL21(DE3）中的大量表达及纯化
        1.2.4 融合蛋白的肠激酶酶切及纯化
        1.2.5 反相高效液相色谱鉴定重组表达的Brevinin-2GUb
        1.2.6 圆二色光谱测定Brevinin-2GUb的二级结构
        1.2.7 质谱检测重组表达的Brevinin-2GUb是否形成二硫键
        1.2.8 Brevinin-2GUb的溶血活性测定
        1.2.9 Brevinin-2GUb对INS-1细胞的促进胰岛素分泌活性鉴定
        1.2.1 0 数据统计分析
2 结果与分析
    2.1 p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb重组质粒的构建
    2.2 融合蛋白的重组表达及纯化
    2.3 融合蛋白的肠激酶酶切及纯化
    2.4 反相高效液相色谱鉴定重组表达的Brevinin-2GUb
    2.5 圆二色光谱测定Brevinin-2GUb的二级结构
    2.6 质谱检测重组表达Brevinin-2GUb是否形成二硫键
    2.7 Brevinin-2GUb的溶血活性分析
    2.8 Brevinin-2GUb的促胰岛素分泌活性鉴定
3 结论



本文编号：3745547