新型靶向抗肿瘤药物LPO的研究

发布时间：2017-05-19 07:09

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【摘要】：豹蛙酶(Onconase,ONC)是一种新型抗肿瘤制剂,能够在体内靶向的选择杀伤肿瘤细胞,是目前世界上新研发的抗肿瘤药物,现已开展恶性间皮瘤的临床三期试验及非小肺癌的Ⅰ/Ⅱ期临床试验。由于ONC具有良好的安全性,能够延长肿瘤患者的生存期。同时临床试验数据也显示出了ONC的一些弊端:(1)ONC的药代动力学试验与体内分布学试验结果不佳;(2)它的分子量较小,仅为104个氨基酸组成的小分子蛋白,由于选择性不高,进入体内后不能迅速作用于癌细胞,在体内半衰期较短,且有严重的肾毒性,因此在临床应用时不能大剂量、短周期的用药,对肿瘤治疗造成了一定的阻碍。在本课题中,针对ONC的诸多不足进行了基因修饰。(1)针对ONC选择性差,本研究为其添加了可靶向作用于癌细胞的导向因子LHRH。加入导向后使重组ONC蛋白迅速寻找并特异性结合癌症细胞,减少在血液中停留的时间,增强了ONC的靶向性与半衰期,降低肾毒性;(2)在LHRH后添加了转膜肽,当LHRH识别癌症细胞表面的受体LHRHR后并与其结合,在转膜肽的帮助下,ONC分子快速进入细胞内吞小泡,在内吞小泡中低p H作用下Furin酶发挥作用切割分离ONC单体与LHRH,从而释放ONC进入细胞发挥其核糖核酸酶活性。通过对该药物的靶向性改造,以期获得一种新型抗肿瘤药物候选品种。研究内容1.人工合成带有NcoⅠ、Eco RⅠ酶切位点的重组LPO全基因片段并克隆入PGEM-T载体中,以NcoⅠ、Eco RⅠ内切酶消化PGEM-T-LPO和p ET-20b表达载体,分别回收目的基因片段和载体片段,利用T4连接酶连接载体与目的片段形成新的重组表达质粒。转化E.coli.JM109,通过培养、质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定,选取测序完全正确的重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),以1mmol/L IPTG为诱导剂诱导表达菌生产目的蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约为25%左右,用Triton-x-100、尿素洗涤剂进行包涵体的洗涤,最终通过6mol/L盐酸胍溶解包涵体并进行复性,复性后经阳离子交换层析得到纯度较高的目的蛋白,但重组蛋白复性难度较大,且复性收率较低。研究内容2.重新合成引物,以p ET-20b-LPO为模版,扩增出两端带有Bam HⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点的LPO目的片段,克隆入本室构建保存的p ET-Trx A-SUMO载体中,构建多种分子伴侣融合表达的Trx A-SUMO-LPO表达质粒,将重组质粒转化感受态E.coli.JM109中,培养后小提质粒,由库美公司进行序列测定,选择测序正确的质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),以1mmol/L IPTG为诱导剂诱导表达菌生产Trx A-SUMO-LPO融合蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白以包涵体仍以形式表达,表达量约为30%左右,用5%Triton-x-100、0.5mol/L盐酸胍洗涤包涵体,最终通过6mol/L盐酸胍溶解包涵体并进行复性,增加分子伴侣融合表达后,复性较易,且纯化工艺简便。研究内容3通过对Trx A-SUMO-LPO的纯化及Sumo酶切割,获得到纯度95%的LPO目的蛋白,用Lowry试剂法测定目的蛋白浓度为0.85mg/m L,用含10%FBS的RPMI1640透析后过滤除菌,按倍比稀释浓度加入到每孔含5000个细胞的96孔培养板中,检测LPO对不同肿瘤细胞的抑制和杀灭作用,结果发现LPO对子宫内膜癌Ishikawa细胞有较强的抑制和杀伤作用。
【关键词】：豹蛙酶 LPO 抗癌药物 蛋白纯化
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R979.1;Q78
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文献综述10-23
• 第一章 豹蛙酶的研究进展10-20
• 1.1 豹蛙酶简介10
• 1.2 豹蛙酶主要结构10-12
• 1.3 豹蛙酶的体外作用目标12
• 1.4 豹蛙酶的分子构象12-14
• 1.5 豹蛙酶的细胞生长抑制和细胞毒性特点14-15
• 1.6 豹蛙酶的内化15-16
• 1.7 豹蛙酶内陷后的作用目标16-18
• 1.8 豹蛙酶对细胞循环影响与诱导细胞凋亡18-20
• 第二章 促黄体激素释放激素20-23
• 2.1 促黄体激素释放激素20
• 2.2 LHRH的分布以及功能20-21
• 2.3 LHRH受体的分布以及与肿瘤治疗的关系21-23
• 第二篇 研究内容23-57
• 第一章 pET-20b-LPO基因构建表达及纯化23-34
• 1.1 试验材料23-25
• 1.2 试验方法25-29
• 1.2.1 重组pET-20b-LPO质粒的构建25-28
• 1.2.2 工程菌pET-20b-LPO/ BL21（DE3）的制备与诱导表达28
• 1.2.3 融合蛋白LPO的纯化28-29
• 1.3 结果29-32
• 1.4 讨论32-33
• 1.5 小结33-34
• 第二章 TrxA-SUMO-LPO的构建表达及纯化34-50
• 2.1 试验材料34-36
• 2.2 试验方法36-42
• 2.2.1 重组TrxA-SUMO-LPO质粒的构建36-38
• 2.2.2 重组融合蛋白TrxA-SUMO-LPO的表达优化38-39
• 2.2.3 工程菌株高密度发酵39-41
• 2.2.4 融合蛋白TrxA-SUMO-LPO的纯化41-42
• 2.3 结果42-47
• 2.4 讨论47-48
• 2.5 小结48-50
• 第三章 LPO对体外癌细胞抑制试验50-57
• 3.1 试验材料50-51
• 3.2 试验方法51-52
• 3.2.1 细胞复苏51
• 3.2.2 细胞铺板51-52
• 3.2.3 LPO毒性试验52
• 3.3 结果52-55
• 3.4 讨论55-56
• 3.5 小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-64
• 附录A64-65
• 作者简介65-66
• 致谢66

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李飞;范黎;李伟;吴红;;LHRH-PEG-PHIS胶束的制备与性质研究(英文)[J];纳米科技;2013年04期

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1 王云;NF-κBp65 siRNA对口腔鳞癌Tac8113细胞株增殖、凋亡和耐药的影响[D];泸州医学院;2013年

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本文编号：378018