新型去乙酰化酶抑制剂厚朴酚激活TRAIL通路诱导NSCLC凋亡的机制研究

发布时间：2017-06-20 04:05

本文关键词：新型去乙酰化酶抑制剂厚朴酚激活TRAIL通路诱导NSCLC凋亡的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,其发病率为每年150万人,非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌分型的大约85%。最近的研究显示,肿瘤组织中抑癌基因常会发生表观遗传改变,随之而来的细胞形态的改变与肺癌发展和转移密切相关。基于表观遗传变化的动态和可逆的特点,表观遗传变化是肺癌化学预防和治疗的潜在目标。组蛋白乙酰化和甲基化是肺癌中研究非常广泛的表观遗传机制。组蛋白乙酰化是由去乙酰化酶(HDAC)和乙酰化酶(HAT)共同调节,在非小细胞肺癌的发生和发展中扮演着重要角色。去乙酰化酶在人体中可以分为四类：I型是HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8, Ⅱ型是HDAC4-HDAC7、HDAC9、HDAC 10,Ⅲ型是Sirtl-Sirt7,Ⅳ型是HDAC11。Ⅰ型HDACs在各种肿瘤组织都是高表达的,主要是促进肿瘤细胞增殖和迁移,最终导致预后差和耐药性。因此,大量的研究表明有针对肺癌的去乙酰化酶的抑制剂(HDACi),特别是针对I型HDACs.这些HDACi作为有效的治疗肺癌的抗肿瘤制剂,通过调节细胞凋亡、细胞周期进展,血管生成、转移和迁移达到治疗目的。HDACi可以通过TRAIL信号通路增强肿瘤细胞凋亡的敏感性,其抑制剂可以诱导增加膜表面的TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)的表达,并启动半胱天冬酶(Caspase)级联反应促进凋亡。迄今为止,美国食品药物监督管理局已批准了一些合成的HDACi,包括丙戊酸、曲古抑菌素(TSA)、异羟肟酸和MS-275作为癌症治疗药物。但是,这些抑制剂的副作用和慢性毒性限制其广泛的应用,越来越多的证据证明日常膳食和营养物质中的化合物具有低毒性和强大的生物活性可以通过表观遗传学的作用机理抑制肺癌。因此,来源于天然植物或食物探索新型抗癌药物,可以调节表观遗传学的变化达到治疗和预防非小细胞肺癌的目的是非常必要的。厚朴酚是从厚朴提取的一种生物活性的化合物,具有很多药理活性,例如抗肿瘤、抗抑郁、抗氧化和抗炎的作用。很多证据表明厚朴酚可以作为抗肿瘤制剂治疗多种类型的肿瘤,其包括肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌。厚朴酚作为抗肿瘤制剂可以通过很多分子机制包括非依赖性Caspase诱导凋亡通路和HIF-1α/VEGF信号通路达到抗肿瘤作用。厚朴总酚(PM)也是从厚朴提取的总酚类物质,其包含很多有效成分如厚朴酚、和厚朴酚及厚朴新酚等。有文献报道厚朴总酚可以抑制移植瘤肿瘤的生长。但是,厚朴总酚中还不明确哪些成分起到抗肿瘤作用,也不未阐明总酚类物质是否比单体效果更好。据研究报道,和厚朴酚是厚朴酚的同分异构体,可以抑制表观遗传学中Ⅰ型HDACs的活性。尽管阐明了和厚朴酚抗肿瘤的机制,但是厚朴酚和厚朴总酚的抗肿瘤机制还不够明确,特别是表观遗传修饰机制需进一步阐明。研究目的本文研究目的在于考察厚朴酚和厚朴总酚对人非小细胞肺癌A549和H1299细胞中Ⅰ型HDACs的影响,并探索厚朴酚及厚朴总酚在体内外是否能作为HDACi诱导细胞凋亡。探索和发展新颖有效无毒并能调节表观遗传学的天然化合物对于治疗和预防肺癌是非常有必要的。研究方法本研究采用MTT法、Real-time PCR,流式细胞仪检测细胞周期、流式细胞仪检测凋亡、Western blot、ChIP、裸鼠移植瘤模型、化学诱导肺癌模型和免疫荧光等技术,深入考察厚朴酚和厚朴总酚在体内外的抗肺癌作用及其机制。1.MTT法细胞活力测试取对数生长期的A549、H1299和H226细胞,4000/孔接种于96孔板中,培养24 h后,细胞生长状态良好后,弃去原来培养基,按设计的药物浓度厚朴酚(0,10,20,40,60,80,100,120,150 μM)和厚朴总酚(0,4,8,16,21,26,32,40 μg/mL)分别作用于48 h后停止培养,然后加入0.5 mg/mL的MTT溶液,处理4 h后,弃上清,最后加入150μL DMSO振荡混匀,置于酶标仪中测定其吸光度值,测定波长为570 nm。细胞的活力相对于空白组的生存率为100%计算。2.流式细胞仪检测细胞周期A549、H1299、H226细胞经厚朴酚(0,15,30,60 μM)和厚朴总酚(0,4,8,16 μg/mL)处理48 h后,胰酶消化细胞,用PBS清洗后用预冷的75%乙醇固定细胞,密封保存于4。C冰箱过夜。次日,离心,用PBS洗一次,接着加入1 mL PBS,混匀后过筛,再加入500μL PI,涡旋混匀,然后将细胞置于37。C避光孵育30 mmin,充分混匀后,采用流式细胞仪检测细胞周期,用F1owJo v7.6软件处理数据。3.流式细胞仪检测细胞凋亡A549和H1299细胞经厚朴酚(0,15,30,60μM)和厚朴总酚(0,4,8,16-g/mL)处理48 h后,用胰酶消化细胞,用PBS清洗。然后用100μL 1xBinding buffer重悬细胞,再加入Annexin-V和PI各5 μL,在37。C避光孵育15 min。孵育完后,再加入400 μL lx Binding buffer重悬细胞。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用FlowJo v7.6软件处理数据。4. Real-time PCR检测I型HDACs和TRAL,及其受体基因表达水平A549和H1299细胞经厚朴酚(0,15,30,60μM )和厚朴总酚(0,4,8,16 lag/mL)处理48h后,用TRIzol提取试剂提取细胞的mRNA,然后用逆转录试剂盒将lnRNA逆转录为cDNA。最后用SYBR Green real-time PCR试剂盒扩增cDNA,并用ABI 7500 system定量。5. Western blot方法分析各蛋白的表达水平A549和H1299细胞经厚朴酚(0,1 5,30,60 μM)和厚朴总酚(0,4,8,16 gg/mL)处理48 h后,或者用TSA(500 nM)预处理24 h,用胰酶消化收集细胞,提取总蛋白或核蛋白。蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(压缩胶为5%,分离胶为12%)分离,然后转移至PVDF膜。采用Western blot检测关键蛋白(I型HDACs、Ac-H3、Ac-H4,AC p53, AC p65和凋亡关键蛋白)。利用β-actin和Histone H3作为内参,用ECL化学发光转化信号,蛋白的相对含量采用QuantityOne软件进行分析。6. ChIP方法考察DR5基因的乙酰化位点A549和H1299细胞经厚朴酚(60 μM)和厚朴总酚(16 μg/mL)处理后,用1%甲醛固定,用PierceTM Agarose ChIP Kit提取试剂盒提取DNA。DNA采用H3K27ac (4pg)孵育过夜。纯化的DNA (-1bp～-2500bp,2.5kb)用DR5特异性引物进行扩增,引物序列为正引物：5'-GGCGGCAGAGAAGACTTAAT-3';反引物：5'-CCTGAGGATGGAGACCTTATTTC-3'。采用10%input作为对照。7.建立A549异移植瘤模型考察厚朴酚及厚朴总酚的抗肿瘤作用取对数生长期的2 x106A549细胞混悬于PBS接种于裸鼠右侧腋下。当平均肿瘤体积达到50-100 mm3时,分为4个组,每组7只。实验小鼠采用灌胃给药,具体给药剂量和方法如下：厚朴酚及厚朴总酚(20 mg/kg)溶解于200 μL玉米油中,最终浓度为2 mg/mL,每周给五次；阿法替尼(5 mg/kg)混悬于含有0.5%甲基纤维素和0.4%吐温-80的生理盐水中,最终浓度为0.5 mg/mL灌胃给药每周五次；对照组给予0.1 mL/10g的玉米油,灌胃给药,每周五次。实验小鼠给药时长为4周,实验结束时,处死全部小鼠,剥取肿瘤,记录肿瘤的湿重。肿瘤体积利用游标卡尺每3天测量1次,计算公式为TV(mm3)=1/2×(L×W2),公式中L为肿瘤的纵向长度,W为肿瘤横向长度。8. TUNEL方法检测免疫组化的凋亡细胞选用In Situ Cell Death Detection Kit,POD试剂盒,根据其使用方法,利用TUNEL方法检测体内肿瘤细胞凋亡情况,TUNEL-阳性细胞利用荧光显微镜采集数据。9.化学诱导肺癌模型考察厚朴酚及厚朴总酚的预防作用C57/B6小鼠适应一周后,用600 mg/kg乌拉坦进行造模,每周造模一次,共15周。第一次造模后根据体重进行分组给药,组别为空白模型组、厚朴酚(10mg/kg)、厚朴总酚组(10 mg/kg)。每组为20只,每周给药五次,每周测量体重；给药至30周。30周后进行解剖,取材,并且观察肺部结节及大小。10.统计学分析采用SPSS软件利用单因素方差分析方法(one-way ANO VA)进行数据的统计学差异分析,所有数据结果以mean±SD表示,p0.05认为具有统计学显著性差异。实验结果1.厚朴酚及厚朴总酚抑制非小细胞肺癌细胞的活力采用MTT和流式细胞仪方法考察对A549、H1299和H226细胞的影响。A549和H1299作用于厚朴酚及厚朴总酚48 h后,细胞活力随着浓度增加而减弱,且具有浓度依赖性。2.厚朴酚及厚朴阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡。接着我们考察厚朴酚及厚朴总酚对细胞周期和凋亡的影响。厚朴酚及厚朴总酚使A549和H1299阻滞在G0/G1期,使H226细胞阻滞在S期。此外,随着厚朴酚及厚朴总酚浓度的增加,能显著诱导A549和H1299细胞的凋亡。3.厚朴酚及厚朴总酚抑制非小细胞肺癌细胞I型HDACs的蛋白表达和功能厚朴酚及厚朴总酚能显著抑制细胞活性和诱导细胞凋亡,为了进一步探索其机制,检测其对细胞核内I型HDACs的影响。与对照组相比,厚朴酚及厚朴总酚能显著下调HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8的蛋白水平,且具有浓度依赖性。但厚朴酚及厚朴总酚不能影响I型HDACs基因水平。由于I型HDACs能影响基因中的组蛋白和非组蛋白去乙酰化,因此考察厚朴酚及厚朴总酚对组蛋白Histone H3(H4)和非组蛋白p53、p65的乙酰化作用。厚朴酚及厚朴总酚能显著的增加Histone H3 (H4)的乙酰化(Acetylation, AC)蛋白水平,有趣的是,厚朴酚增加AC Histone H3的蛋白水平较AC Histone H4强。厚朴酚及厚朴总酚也能显著增加非组蛋白p53和p65在A549细胞中的乙酰化水平。在p53缺失型的H1299细胞中,厚朴酚及厚朴总酚能显著增加AC p65的蛋白水平。4.厚朴酚及厚朴总酚激活TRAIL通路诱导细胞凋亡厚朴酚及厚朴总酚抑制I型HDACs,考察其是否可以激活TRAIL通路,影响下游关键蛋白。厚朴酚及厚朴总酚使DR5的基因水平上调。相对于对照组,厚朴酚及其厚朴总酚能显著增加凋亡蛋白Bax的水平,同时,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外,厚朴酚及厚朴总酚诱导DR5、caspase 3、cleaved caspase 3和cleaved PARP蛋白的高表达。然而,厚朴酚及厚朴总酚对caspase 8无明显的影响。5.厚朴酚及厚朴总酚部分依赖抑制I型HDACs诱导细胞凋亡采用Western blot和流式细胞仪考察厚朴酚及厚朴总酚诱导的凋亡是否依赖于I型去乙酰化酶。60μM厚朴酚在A549和H1299细胞可以显著诱导细胞凋亡,凋亡分别为64.40±0.73%和13.67±0.62%。当用HDACi (TSA)预处理24 h后,I型HDACs蛋白表达下降,但在H1299细胞中未显著诱导细胞的凋亡。结果显示用500 nM TSA预处理24 h可以抑制I型HDACs的活性。TSA预处理24h后,继续用60μM厚朴酚处理48 h后,A549和H1299细胞凋亡率下降至39.05±1.48%和42.50±0.71%。相似地,16 gg/mL厚朴总酚用TSA预处理后,细胞A549和H1299细胞凋亡率下降至7.61±0.86%和8.79±0.95%。这些结果显示,厚朴酚及厚朴总酚通过I型HDACs诱导细胞凋亡,但不是唯一机制。同时,厚朴酚及厚朴总酚通过抑制I型HDACs可使DR5基因的启动子区域的H3K27位点高度乙酰化。6.厚朴酚及厚朴总酚抑制I型HDACs而发挥抗肿瘤活性厚朴酚及厚朴总酚通过A549异移植瘤模型考察其体内抗肿瘤作用。相对于对照组,给药组小鼠体重无统计学差异,同时,阿法替尼、厚朴酚及厚朴总酚能显著的抑制肿瘤体积。厚朴酚及厚朴总酚对肿瘤的抑制率分别为44.40%和35.45%。利用Western blot方法检测各关键蛋白的表达水平,结果显示厚朴酚及厚朴总酚抑制1型HDACs (HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)的蛋白水平。此外,厚朴酚及厚朴总酚上调AC histone H3、AC histoneH4、AC p53和AC p65的蛋白水平。通过免疫荧光检测体内肿瘤细胞的凋亡率,结果显示,厚朴酚及厚朴总酚诱导的凋亡细胞明显较对照组多。同时,厚朴酚及厚朴总酚增加DR5、Bax、caspase 3、cleaved caspase 3、cleaved PARP和caspase 8的蛋白水平,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达。7.厚朴酚及厚朴总酚预防肺癌的发生和发展与空白对照组相比,厚朴酚及厚朴总酚能有效的减少肺部结节,且无明显毒性,可以作为预防药物长期给药。主要结论综上所述,本研究证实厚朴酚及厚朴总酚作为1型HDACi,阻滞细胞周期和激活TRAIL通路诱导细胞凋亡而发挥抗肺癌作用。1.厚朴酚和厚朴总酚对A549、H1299、H226细胞有较强的抑制作用,其中,对A549和H1299细胞的抑制最强,且可以诱导A549和H1299细胞的凋亡。2.厚朴酚及厚朴总酚抑制I型HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8的蛋白水平。同时,通过是组蛋白和非组蛋白乙酰化,增加AC Histone H3、AC HistoneH4、AC p53和AC p65的蛋白水平。3.厚朴酚和厚朴总酚通过下调G0/G1期关键蛋白cyclin D1使A549和H1299阻滞在G0/G1期。4.厚朴酚及厚朴总酚能作为I型HDACi激活TRAIL通路诱导A549和H1299的细胞凋亡,但不是其诱导凋亡的唯一机制。5.厚朴酚和厚朴总酚通过抑制I型HDACs抑制A549异移植瘤的生长而发挥抗肿瘤作用。在体内,厚朴酚和厚朴总酚可以通过TRAIL通路诱导体内肿瘤细胞的凋亡。在化学诱导肺癌模型中,厚朴酚及厚朴总酚能预防肺癌的发生和发展。
【关键词】：厚朴酚 厚朴总酚 去乙酰化酶 TRAIL 非小细胞肺癌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
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